遗传关联研究1、前言噪声是生活中最普遍的环境污染之一(Yuen,2014)。
长期暴露于噪声中可能 会导致噪声性听力损失（Noise-induced hearing loss，NIHL）。
全球约有5%的人口遭受工业，军事或娱乐性噪声的困扰，数百万人暴露在有害的噪声环境中(Oishi&Schacht,2011)。
NIHL严重影响了个人的生活质量，给社会造成了巨大 的经济损失(Seidman&Standring,2010)。
听力下降被认为是遗传因素和环境因素共同作用所导致的结果(Konings et al.,2009)。
已知的环境因素包括噪音、吸烟、接触有机溶剂、高血压、胆固醇升 高等(Rabinowitz et al.,2008;Wu et al.,2017)。
动物研究证实遗传因素与听力下降 有关(Davis et al.,2001;Li,1992;Sliwinska-Kowalska&Pawelczyk,2013)。
例如， 基因敲除小鼠（如Pmca2-/-、Sod1-/-、Gpx1-/-和Cdh23+/-）相比于同窝野生型小鼠，更容易受到噪声的影响，导致听力下降(Sliwinska-Kowalska&Pawelczyk,2013)。
人类双胞胎研究也表明，遗传因素在NIHL的发展中起着重要作用(Johnson et al., 2017)。
候选基因研究已发现多个单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphisms，SNPs）与NIHL的风险显著相关。
这些SNPs所标记的候选基因 主要分为以下四类(Sliwinska-Kowalska&Pawelczyk,2013)：（i）氧化应激基因， 如CAT，SOD1和SOD2；（ii）内耳钾离子循环通路基因，如KCNQ4和KCNE1； （iii）HSP基因，如HSP70；（iv）单基因性耳聋基因，如PCDH15、MYH14。
最近，一项针对包含25例听力下降病例和23例听力正常对照者的欧洲人群GWAS显示，核蛋白（Nucleoprotein，NCL）基因上的一个SNP（rs7598759）与 NIHL的风险显著相关(Grondin et al.,2015)。
然而，这些发现并不足以解释NIHL 全部的遗传度。
此外，已发表的NIHL的GWAS样本量有限，且在中国人群中 从未有NIHL的GWAS报道。
为了在中国人群中发现与NIHL易感性相关的基因，我们对89例NIHL患 者（病例）和209例听力正常的受试者（对照组）开展了GWAS分析，然后在 包含53例NIHL病例和360例对照的独立人群中进行验证分析。
结果发现， 7q11.22的rs35075890和7q36.3的rs10081191是新的NIHL易感位点。
这些发现 扩展了我们对NIHL遗传学基础的理解。
2、材料与方法我们在中国人群中开展了一个两阶段的GWAS研究，共包含了711例中国 男性。
发掘阶段包含298例受试者，验证阶段包含413例受试者（表1-2-1）。
研 究对象均来自某省某市某单位2018年3月至2019年9月职业性噪声暴露环 境的作业人员。
这些作业人员每天暴露在超过100分贝（Decibels，dB）的噪音 中8小时（Hour，h）以上。
所有受试者均无与听力相关的并发症、耳外伤，也未患有某些药物或毒素所致的耳毒性以及中耳炎。
纯音测听由训练有素的医生根据标准程序使用Madsen Voyager 522测听仪（Kastrup，丹麦）在测听室对每个受 试者进行检测。
在最后一次接触工作场所噪声至少12 h后进行纯音测听，以避 免暂时性阈值偏移。
在250 Hz、500 Hz、1,000 Hz、2,000 Hz、4,000 Hz、8,000 Hz的频率下，测试研究对象双耳能听到最小声音的听力阈值。
根据世界卫生组织的分类，如果受试者两侧耳朵的最小听力阈值大于25 dB，则该受试者可视为NIHL (Lohler et al.,2019)。
此外，还采用结构问卷的方式收集研究对象的人口统计学因素、噪声暴露时间、噪声暴露强度和双耳听力阈值等信息。
根据这一标准，发掘阶段共计89例病例和209例对照，验证阶段共计53例病例和360例对照。
发掘阶段人群：该人群共包含298例参与者，包括89例病例和209例对照。
所有研究对象均是在2018年3月从安徽省蚌埠市职业噪声暴露环境中的男性工 作者中招募的受试者。
病例和对照组的平均年龄（标准差）分别为23.8（1.5） 岁和23.3（1.6）岁。
所有研究对象均采用Illumina Infinium Asian Screening Array-24（v1.0）进行基因分型。
验证阶段人群：该人群共包含413人，包括53例病例和360例对照。
研究 对象均为2018年8月至2019年9月安徽省蚌埠市职业噪声暴露环境中的男性工 作者。
病例和对照组的平均年龄（标准差）分别为26.5（5.7）岁和24.5（2.5） 岁。
总的来说，在发掘阶段和验证阶段，病例的平均年龄显著大于对照组（P分 别为0.07和6.00×10-3）。
在所有的基因分型实验中，研究人员均不知道所有参 与者的病例/对照状态。
发掘阶段的基因分型和质量控制发掘阶段的病例和对照样本使用Illumina Infinium Asian Screening Array-24 （v1.0）芯片进行基因分型，该芯片包含659,184个SNPs位点。
我们对样本和 SNPs进行了严格的质量控制，以保证后续可靠地的遗传关联分析(Li et al.,2016; Li et al.,2018)。
简单地说，如果样本满足以下条件则被排除：（i）样本个体基因 分型率<90%；（ii）样本性别信息缺失;（iii）样本出现重复或亲缘关系（PI_HAT> 0.025），或是（iv）被认定为异常样本个体。
使用全基因组复杂性状分析软件 （Genome-wide Complex Trait Analysis software，GCTA）进行主成分分析（Principal component analysis，PCA）用于检测离群值(Yang,Lee,Goddard,& Visscher,2011)。
SNPs被排除的条件是:（i）SNPs分型率<90%；（ii）次等位基 因频率（Minor allele frequency，MAF）<0.05；（iii）位于性染色体上；（iv）在 发掘阶段，人群中的哈迪-温伯格平衡测试的P值小于1.00×10-4。
在完成质量控 制之后，共有89例病例和209例对照以及302,253个SNPs留待后续分析。
SNPs的基因插补为了增加发掘阶段数据集中SNPs的覆盖范围，我们使用SHAPEIT软件 （Version 2）和IMPUTE2软件（Version 2.2.2）对发掘阶段的SNPs进行了基因 插补。
千人基因组计划数据（第3版）被用作参考数据集。
将由SHAPEIT软件 构建的单倍型直接导入IMPUTE2软件。
我们将推算结果中后验概率大于0.6的 SNPs纳入后续的分析。
为保证后续分析的质量，我们对推算出来的SNPs进行 了质量控制，保留满足以下质量控制条件的SNPs，包括:（i）SNPs分型率大于 90%；（ii）MAF大于0.05；（iii）哈迪-温伯格平衡测试的P值大于1.00×10-4。
剔除多等位基因的SNPs（四等位基因SNPs和三等位基因SNPs）。
最后，我们 在89例患者和209例对照中总共获得3,830,413个SNPs。
发掘阶段的全基因组遗传关联分析我们使用PLINK（Version 1.90）进行SNPs与表型的遗传关联分析 (Mostowska et al.,2018;Renteria,Cortes,&Medland,2013)。
我们在加性模型下进 行logistic回归分析，并校正年龄和噪声暴露时间。
曼哈顿图-log10（P）和分位 数（Quantile-quantile，Q-Q）图是使用R（Version 3.5.0）生成的。
使用λ膨胀系数评估关联研究是否存在系统性偏差。
2.6验证阶段的基因分型、质量控制和遗传关联分析我们筛选发掘阶段P≤1.0×10-4的SNPs，共选择了262个SNPs。
这262个 SNPs被导入到Haploview（v4.2）软件中。
通过设置连锁不平衡（Linkage Disequilibrium，LD）阈值（r2<0.05），将强LD的SNPs归为一个基因座。
结果 发现，这262个SNPs分别位于29个基因座。
然后，选择每个基因座中的一个 SNP用于随后的验证。
我们优先考虑那些直接通过基因分型的所产生的SNPs， 而不是通过基因插补出来的SNPs，因为即使较低的推算错误率也可能对后续的 分析产生重大影响(Li,Willer,Sanna,&Abecasis,2009;Marchini&Howie, 2010)。
最终，我们共筛选出29个SNPs。
我们采用Sequenom基因分型法，对候 选SNPs进行基因分型。
简单地说，位点特异性聚合酶链反应和引物是使用 MassARRAYAssay Design 3.0软件（Sequenom，Inc.,USA）设计的。
每个样本 约15 ng的基因组DNA用于SNPs基因分型。
使用多重PCR扩增DNA，并将产物用于位点特异性单碱基延伸反应。
将所得产物脱盐并转移到384元素光谱芯片 阵列中。
采用MALDI-TOF-MS进行等位基因检测。
对Sequenom基因分型法得到的基因型数据进行聚类分析，并使用肉眼检查以确认其质量良好。
对验证阶段的基因型数据进行与发掘阶段相同的质量控制。
由于rs56328361未能成功进行 基因分型，最终得到了28个分型成功的SNPs。
在验证研究中，随机抽取5%的 个体重复基因分型，基因分型结果一致率为100%。
最终，在验证阶段发现， rs35075890和rs10081191显著关联（P<0.05），且效应方向与发掘阶段相同。
由 于19例参与者的噪声暴露时间在验证阶段缺失，因此我们用验证阶段所有参与 者的平均噪声暴露时间（2.4年）进行替换，作为缺失数据的补充。
随后，我们 使用PLINK（version 1.90）在加性模型条件下对验证阶段中的样本进行遗传关联分析，并且校正了年龄和噪声暴露时间。
通路分析在发掘阶段，利用多标记分析基因组注释软件（Multi-marker Analysis of GenoMic Annotation，MAGMA）在全基因组遗传关联基础上进行通路富集分析 (de Leeuw,Mooij,Heskes,&Posthuma,2015)。
该通路富集分析是一种新的有效策 略，可以检测到传统GWAS缺失的遗传关联，并探索疾病的生物学机制(de Leeuw et al.,2015)。
MAGMA用F检验计算基因P值，然后用回归模型进行基 因集分析。
本研究中参考的数据集共包括了186个京都基因与基因组百科全书 （Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）数据集、289个BioCarta 基因数据集，196个通路相互作用（Pathway Interaction Database，PID）数据集 和1499个人类生物学反应及信号通路数据集（Human Biological Response andSignal Pathway Database，Reactome）。
采用本杰米尼·霍奇伯格 （Benjamini-Hochberg，BH）法进行多重检测校正，错误发现率（False discovery rate，FDR）小于0.05被认为有统计学意义。
3、讨论在本研究中，我们对NIHL进行了GWAS。
据以往的文献调研，这是我国首 次针对NIHL的GWAS研究。
我们在7q11.22（rs35075890）和7q36.3（rs10081191） 确定了两个新的位点，这两个位点有助于了解NIHL的易感性。
4、总结本文基于全基因组遗传关联研究策略，以发现噪声暴露后两种重要疾病（噪 声性听力下降和噪声性耳鸣）的遗传易感基因。
我们的研究将有望为噪声环境听 觉疾病的防诊治提供新的理论基础。
基于全基因组遗传关联研究策略，我们通过发掘和验证阶段共计142例噪声 性听力下降病例和569例听力正常对照的研究，发现7q11.22（标记SNP位点 rs35075890）和7q36.3（标记SNP位点rs10081191）是噪声性听力下降的遗传易 感区域。
e QTL分析显示，7q11.22区域的rs35075890在多种脑组织中与AUST2 基因的表达显著相关，而7q36.3区域的rs10081191在多种脑组织中与该区域的 PTPRN2和WDR60基因的表达显著相关（P<0.05）。
LocusCompare在线工具的 共定位分析表明，NIHL显著相关的SNP-rs35075890信号与脑组织中7q11.22基 因座的e QTL数据之间具有显著共定位信号，而另一个NIHL显著相关的 SNP-rs10081191信号与脑组织中的PTPRN2基因座（7q36.3）的e QTL数据间具 有显著共定位信号，但是与脑组织中的WDR60基因座（7q36.3）的e QTL数据间不具有显著共定位信号。
综上，我们发现与噪声性听力下降相关的三个候选易感基因AUST2、PTPRN2和WDR60。