文/纵观人间事

编辑/纵观人间事前言棕黑锦蛇是中国地区的一种重要经济动物，其主要分布在黑龙江省、吉林省等地，仅在辽宁省的东边山区存在，但其分布范围仅限于南部。
赤峰锦蛇是中国长江北部和长江盆地的重要组成部分，其在内蒙古的分布区为最北端，而在朝鲜以外的地区则是其重要的分布区。
两种植物在辽宁省与朝鲜有一定的交互性。
因此，深入了解褐斑锦蛇与赤峰锦蛇的现有群体，对其进行系统的遗传多样性及相应的保护措施，是当前亟待解决的问题。
但有关褐斑锦蛇和赤峰锦蛇的相关研究主要是从形态解剖、细胞遗传学、保护生物学等角度进行的，对它们的基因组多态性和群体遗传多样性缺乏深入的了解。
本项目以中国东部三省特有的褐黑锦蛇和赤峰锦蛇为材料，采集12个群体41份样本，采用mtDNA片段测序技术。
对褐黑锦蛇和赤峰锦蛇的群体遗传学特征进行系统的比较，探讨褐黑锦蛇和赤峰锦蛇的群体遗传学特征。
材料与方法本文从九个采样点收集了褐黑锦蛇及赤峰锦蛇样品41条（见图1）。
根据地域和远近，将褐纹锦蛇取样点划分为6个地域：黑龙江大佳河乡，牡丹江，吉林露水河镇，沈阳，新宾，本溪；赤峰锦蛇的取样地点按地域和远近划分为辽宁6个地域：沈阳，新宾，本溪，抚顺，岫岩，营口（见表1）。
根据地理上的邻近性，将已有的采样地点按两个采样地点相隔不大于60公里的直线进行分类。
对其进行外观鉴定，并作详细的登记，然后将其在现场切割后，将其尾巴上的肌细胞放置在含有95%乙醇的组织化管内，然后将其保存在-20℃的冷冻库中，再将其放入活体中。
采用田根菌基因组萃取工具对样本进行DNA的萃取。
利用上海生工科技有限责任公司生产的普通引物L14919、H16064对Cyt6的全长进行了PCR扩增。
最终，72-General8mino的PCR结果用琼脂凝胶电泳分析，并将其送入上海生工公司，进行提纯和提取，并进行2D序列测定。
采用DNASTAR分析程序对得到的序列进行编辑，校对，分类。
采用DNASP分析方法，对单个基因的多态性、多态位点、插入/缺失等指标进行分析，并采用Fsnon-test方法对其进行分析。
在此基础上，利用MEGA分析了两个种群之间的基因分布。
采用ARLEQUIN软件对两组的群体数据进行AMOVA统计。
利用MRBAYES分析工具，建立了一个以AIC判据为基础的HKY+I模式为基础的贝叶斯支撑树，还利用NETWORK软件建立中间层的关系。
结果与分析本研究拟对41条棕色锦蛇和赤峰锦蛇Cytb基因进行全基因组测序，剔除不能精确测序的片段，将其编码区置于密码子首。
得到1086bPo,18条棕色锦蛇Cytb基因存在3个突变位点，未发现任何碱基丢失和插入，变换/倒置比例为14和645。
结果表明：A、T、G、C碱基平均含量分别为33.4%、27.3%、II.0%、28.3%、赤峰锦蛇属23个基因片段均存在3个突变位点。
未发现任何一种基因片段的丢失和插入现象，其突变/反转比率为0.006。
A、T、G、C碱基平均含量分别为33.5%、27.3%、10.9%、28.3%。
棕色锦蛇的18条序列一共限定了4个单倍型，单倍型Hapl由MDJ、LSH、SY、XB、BX共5个族群共有。
在这5个族群中，它们分别为4/5、l/l、2/3、6/6、2/2Hap2为DJH族群独有，占1/lHaP3为SY族群独有，占1/3Hap4为MDJ族群独有，占1/5（表2）。
赤峰锦蛇属23个基因片段，共有3个单体型，单体型Hapl为6个群体共有，6个群体中1/2,2/2,7/7,7/7,1/2,3/3Hap2为SY群体所独有，1/2HaP3为XY群体所独有（表3）。
棕色、黑色、赤峰两个锦蛇的12个地理群体的基因多样性系数见下表4，群体中的样本量N>1时，DHJ群体和LSH群体的基因多样性系数被剔除。
赤峰锦蛇总体单倍型数为3,单倍型多样性为0.170,核苷酸多样性为0.00024,平均核昔酸差异数为0.2609。
采用ARLEQUIN对居群的基因分化指标进行了计算（表5、6）。
棕色锦蛇组的Fs值以DJH组和LSH组、XB组和BX组为最大，其它组为负（表5)。
对赤峰锦蛇种系进行了统计，发现在SY与BX,FS居群之间，XY与BX,FS居群之间，其它居群之间，Fs值均低于其它居群（表6）。
在褐黑锦蛇和赤峰锦蛇种内，与Fs值相对应的不同种群之间的遗传流动情况见下图5和下图6。
褐黑色锦蛇中锰含量最高的是MDJ和XB种群，其次是MDJ和SY种群，其它种群的锰含量不是无穷大就是很低（表5）。
利用MEGA软件，以Kimura二参数模式为基础，对棕色锦蛇组和赤峰锦蛇组进行了基因距离的分析（表7）。
通过对6个褐斑锦蛇居群的基因型进行了分子生物学研究，结果表明，在6个居群中，基因型和基因型分别为30.97%和69.03%。
在6个居群中，基因型和基因型分别为37.12%和62.88%。
在赤峰锦蛇居群中，基因型和基因型分别为62.88%（见表8）。
根据Cytb的基因对黄斑锦蛇和日本四纹锦蛇黄斑锦蛇作为贝叶斯进化关系的研究结果。
棕色锦蛇与12个群体共41只赤峰锦蛇共12个群体（见图2)，其中，第1群体包含23只赤峰锦蛇，第2群体包含18只棕色锦蛇。
在单基因型之间的分子谱系上，褐黑锦蛇和赤峰锦蛇单基因型都有自己的聚类群，这一点与种树所得出的结论相符。
褐斑锦蛇种间的遗传网络为辐射状，只有一个主要单体型亚群，亚群为5个群体所共有，没有DJH群体。
Hap3是SY群体的特异性位点，Hap4是MDJ群体的特异性位点；在5个具有共同hapl的群体中，hapl出现的次数都是最多的。
所有单体型间都有很好的亲缘性，除主要单体型外，其它单体型都是通过两个步骤获得的。
赤峰锦蛇种间的亲缘关系为辐射状，其亲缘关系为1个主要单体型，且为6个居群所共有；Hap2是SY群体的特异基因，Hap3是XY群体的特异基因。
在所有人口中，Hapl出现的频度都是最大的；各个单体型的相关性很接近，除主体单体型以外的其它单体型并不都是通过两个步骤来实现，最多仅通过三个步骤来实现（图3）。
目前，运用mtDNA序列进行居群历史研究的研究，已有一些学者提出了一些新的思路，如：中性检验、歧点分布法等。
采用DNASP软件，对棕色和黑色锦蛇和赤峰锦蛇群Cytb基因的序列进行了中性检验，结果表明：在赤峰锦蛇群中，FuandLfsFs参数为明显的负值，而在其它总体种群中，各参数为不明显的负值。
通过对棕色和棕色两种锦蛇和赤峰两种锦蛇种群的基因序列的歧点分布进行了研究，获得了Cytb基因在棕色和赤峰两种锦蛇种群中的歧点分布（见图4）。
讨论研究植物的基因多样性，可以帮助我们了解植物的起源和演化过程。
遗传多样性是生物对环境的适应性与演化的重要依据。
充足的基因资源能够保持群体的稳定性，而基因资源的缺乏则会对群体的存活构成严重威胁。
总体上讲，如果一个群体长期相对稳定，资源充足，则其群体有可能保持较高的基因多样性；在群体中存在“瓶颈”现象时，群体内的遗传变异会因基因漂变而减少。
通过Cytb基因测序，对来自黑龙江省，吉林省，辽宁省和赤峰地区12个居群41个个体样本进行了Cytb基因测序；棕黑锦蛇群体中仅发现4个单倍型,6个种群中没有所有种群共享的单倍型。
赤峰锦蛇群体中仅发现3个单倍型,6个种群中有所有种群共享的单倍型为Haplo棕黑锦蛇的不同地理群体间总体单倍型多样性Hd值和核苷酸多样性it值分别为0.314和1.894%。
总体上表现出较低的单倍型多样性和较高的核苷酸多样性。
赤峰锦蛇种内各地理种群的整体单体型多样性Hd和Nucleotide差异it分别为0.170和0.024%，显示出整体上的个体类型和Nucleotide差异很小。
棕色锦蛇单倍型多样性较少，核苷酸多样性较高，说明棕色锦蛇单倍型多样性较高，说明棕色锦蛇单倍型多样性较高，存在着“瓶颈”和“创始人”效应。
此外，由于物种的快速进化和较短的生命周期，以及样本数量少和分布不均等原因，对物种的遗传多样性也有一定的影响。
赤峰锦蛇的单体型多样性低，核苷酸多样性低，说明只有几个点的变异，在短期内不足以累积到一定数量的核苷酸多样性，造成群体核苷酸多样性低。
另外，人类活动如过度捕捉、环境污染、生境破坏等也会导致物种的损失。
结语用Cyt6对两个群体进行了比较，发现两个群体的基因多态性都很差，但褐斑锦蛇比红斑赤峰锦蛇高一些。
褐黑锦蛇和赤峰锦蛇的少数居群出现了分化，但居群规模基本保持不变，并未出现显著的居群扩大现象。
为了更好地保存这两个品种的基因多样性，应对这两个品种分别实行分类管理。
参考文献：[1]季达明，刘明玉,周玉峰《辽宁动物志两栖类爬行类》[2]赵尔宓，黄美华,宗愉,等《中国动物志爬行纲》[3]周正彦《棕黑锦蛇与赤峰锦蛇是相近种或是亚种关系》[4]赵尔宓《中国蛇类》