文 | 肖筱编辑 | 肖筱«——【·前言·】——»叶部疾病在大多数作物中造成了严重的损失，在不进行杀菌剂防护的情况下，疾病的早期检测是控制疾病的先决条件，在这种情况下，“早期”是指在预兆症状出现之前的合适时机进行治疗。
病害的治疗控制有助于减少农业中的杀菌剂使用量，对植物与兼容病原体的相互作用，进行深入了解，可以帮助开发复杂的预兆症状疾病检测方法，植物受到兼容的植物病原体的攻击，可能导致数千个差异表达基因，在感染后的几个小时或几天内出现变化。
在番茄叶片中，通过比较灰霉病菌感染和模拟感染组织，约有4700个DEGs在感染后24小时被鉴定出来。
«——【·空间差异基因揭示早期B. cinerea-番茄感染情况·】——»在实验设置中，24小时的感染时间比可见症状发展要早，灰霉病菌感染引起的一些基因的系统性表达，可以帮助在症状发展前识别疾病，即使是从外观上健康的组织中取样，这可以成为一种有价值的控制方法，例如用于提供健康的番茄苗。
先前的文献中曾报道了在同一植物的感染和未感染叶片之间，差异表达基因的空间调控，在接种了灰霉病菌的莴苣叶片中，在感染部位的近邻发现了825个DE，在相同莴苣的未接种叶片中，并没有发现受到灰霉病菌接种诱导的DEG。
这些基因是在接种叶片中强烈上调的一组基因之中，在其他植物-病原体系统中，也发现了其他不同的空间差异表达模式，在感染马铃薯普通疫霉菌后的35和96小时，非感染叶组织中的几丁质酶和苯丙氨酸解氨酶mRNA表达增加。
1,3-beta-葡聚糖酶mRNA也在系统性诱导，同一辣椒和烟草植株的接种，和非接种叶中倍半萜类抗生物质合成酶编码基因的上调，这些争议性的结果和不同基因的参与，不允许直接开发一种通过采样非感染组织，进行灰霉病菌疾病检测的方法。
从B. cinerea-番茄相互作用中，选择了25个最强的早期上调基因中的四个基因，它们属于编码F-box-like蛋白、细胞色素P450和FAD结合域蛋白的基因，已经证明F-box基因参与了多个调节功能级联，如蛋白质相互作用和细胞周期调节，以及病原体介导的细胞死亡。
细胞色素P450酶蛋白超家族，参与生物逆境和非生物逆境的应答，它们在植物抗生素合成、激素代谢以及萜类化合物、生物碱和氰基葡萄糖甙的合成中起重要作用，含有黄素腺嘌呤二核苷酸结合域的蛋白参与多种过程，包括电子传递到氧化还原中心和氧化和羟基化的活化。
进行了两个不同的实验，调查了受到B. cinerea滴菌感染的番茄复叶中，这些差异表达基因的空间表达，其中一组实验在易感番茄叶组织的尖叶片，或侧叶片上挑战了B. cinerea 24小时。
对于这四个基因，报告了在感染了单个B. cinerea悬浮液滴，或模拟接种液的番茄复叶内，24和48小时的系统性表达情况。
«——【·植物材料·】——»番茄植物在标准土壤中生长，在一个半受控的温室中，窗户是敞开的，温度设定为20-26摄氏度，夏天阳光充足的日子最高可达40摄氏度，在阴天，使用人工光源每天提供最低80千瓦的恒定照明，持续16小时。
每周一次，从受过硫磺处理的番茄“母”植物中制作插条，插条随后在相对湿度约为100%的环境中生根一周，它们被逐渐适应上述相同的温室条件，从两周大的插条上收获年轻而完全展开的叶片，用于接种试验。
将六片复叶放置在迷你种植箱中，在用蒸馏无菌水湿润的纸巾上，用于病原体接种和模拟接种的是分开的种植箱。
«——【·相对mRNA表达分析的接种物处理、采样和分析方法·】——»肥力黑斑菌T4菌株在含有15克/升麦芽琼脂的培养皿上培养3-8周，孢子使用20毫升半浓度葡萄汁收集，并稀释至每毫升1.2×106个孢子，孢子悬液直接用于接种，将10微升的悬液滴在主要叶片或侧叶片的上表面。
接种的叶片在18摄氏度的黑暗条件下储存，模拟接种在相同条件下使用半浓度葡萄汁进行，进行了两个实验系列，在A实验中，接种在顶部叶片的中央，在B实验中，接种在侧面叶片。
A和B实验分别独立重复了三次，每个实验重复和接种菌剂中接种了六片叶子，先将两片叶子取样汇集起来进行进一步分析，作为备份，第三对叶片用于感染后四天观察孢子产生的感染控制。
备份只在样品丢失的情况下使用，例如在RNA提取过程中丢失，在接种24小时后和48小时后，用直径为5毫米的软木钻切割接种部位以及额外的部位，用纸巾去除LD上的剩余接种菌剂，混合两片不同的复叶的LD，并用液态氮进行冻存，样品在-80摄氏度存储，直到进一步处理。
«——【·RNA提取和实时荧光定量PCR技术·】——»按照制造商的说明提取总RNA，包括DNase处理，使用微量分光光度计估计RNA的质量和数量，使用iScript cDNA合成试剂盒将总RNA转录为第一链cDNA，从先前的RNA-seq研究中选择了四个上调基因。
针对每个基因，使用Primer3软件设计引物组，引物对LSM7和SlCBL1用于扩增持续表达的基因，分别编码U6 snRNA相关的Sm-like蛋白LSm7，和类钙调素B蛋白的参考基因，使用0.2µM的前向和反向引物，以及1µl的模板在LifeCycler480上进行qPCR反应。
使用Fast EvaGreen qPCR Master Mix进行反应，对于使用的所有引物对，使用由引物供应商建议的快速扩增协议，包括95°C的初始变性2分钟，然后40个循环，95°C变性5秒，60°C退火30秒。
在运行结束时，进行从60°C到100°C的融解曲线分析，每0.1°C递增，所有样品进行了重复分析，引物效率和参考基因的稳定表达已经在先前的研究中进行过评估，基于ΔΔC(t)-方法使用GenEx v6软件，分析了病原体感染样品与模拟感染样品的相对表达水平。
应分析非感染样品的相对表达值与接种样品之间的关系，以便衡量基因表达的差异，这包括一个多层次相对分析，由数个关系和归一化步骤组成，目标基因的qPCR阈值循环数进行效率校正，重复样本求平均，并归一化到参考基因LSM7和SlCBL1的Ct值。
使用B. cinerea接种的叶片的值，与相应的参考模拟感染样品进行归一化，在感兴趣的位置得到的值被归一化到接种点，为了显示并使用Tukey的多重比较均值检验，进行显著性差异测试，将数据进行了log2转换，根据定义，IS的值为零，POI以负值显示，因为POI的差异表达比IS要弱。
«——【·尖端小叶接种·】——»在番茄化合叶中，通过接种在顶尖叶片的中心处，在顶尖叶片的不同位置上取了四个样本，两个位于不同侧叶片的中心，以及两个沿叶轴，在接种点LD1处，基因的表达水平在24小时后最高的补充。
与其他取样位置相比，F-box-like、两个细胞色素P450以及FAD结合域蛋白在IS中显示出明显上调的差异，通过使用Tukey多重比较均值，将24小时后的LD1a-c、LD2-LD3、R1和R2相对基因表达与LD1进行比较。
发现化合叶中所有取样位置上的FAD结合域蛋白，和细胞色素P450的上调没有显著差异，对于F-box-like和细胞色素P450，发现与IS相比，在某些取样位置上存在显著较低的上调。
«——【·侧传接种·】——»在第二个实验中，在侧叶片的LD4位置接种，并在24和48小时后进行取样，与实验A类似，模拟接种减去病原菌接种的样本的修正Ct值差异显示IS具有最高值，在24小时后，对于两个细胞色素P450以及FAD结合域蛋白。
在取样位置的叶轴和IS之间在表达上没有显著差异，在24小时后，与叶轴另一侧的叶片相比，叶片LD4内所有四个目标基因的表达显著不同，在48小时后，所有取样位置均表达了目标基因。
对于所有四个测试基因，在48小时后的取样位置之间没有找到显著差异，细胞色素P450在整个叶片上以相对较低但可比的强度表达，与24小时后相比，模拟接种减去病原菌接种样本的修正Ct值差异的标准偏差较高。
«——【·未感染花轴组织中的基因表达水平·】——»选择了两个细胞色素P450基因，和一个含有FAD结合结构域的蛋白基因作为研究对象，来探究未感染花轴组织中基因表达的变化情况，这些基因在先前的研究中，已经证明在灰霉病感染组织中显示出显著的上调。
通过采集未感染花轴组织样本，使用了实时荧光定量PCR技术来检测和分析基因表达水平，通过与参考基因的比较来确定基因的表达变化，并使用统计学方法对结果进行了验证，在研究结果中，观察到在未感染花轴组织中，基因A的表达水平相对于参考基因呈现了明显的上调趋势。
对于基因B和基因C，虽然其上调幅度较小，但仍然显示了与感染组织相似的趋势，进一步的分析表明，这些基因在未感染花轴组织中的表达水平，与感染组织存在一定的差异，但总体上表现出上调的趋势。
这提供了一种可能性，即未感染花轴组织中的基因表达变化，可以作为灰霉病感染的指示器，通过研究未感染花轴组织中的基因表达水平，可以更好地理解灰霉病的感染机制，以及植物对病原真菌的防御反应，这些结果还为开发基于基因表达的快速检测方法提供了潜在的线索，以便在无症状叶组织中准确检测灰霉病感染。
«——【·讨论·】——»所提供的结果表明，在24和48小时后，在远离感染位置的组织中，叶片范围内的基因调控受到真菌感染的影响，比较患病和模拟感染的化合叶时，当接种顶尖叶片时，细胞色素P450和FAD结合域蛋白的表达，在整个化合叶上没有显著差异。
与修正Ct值的差异相比较，接种点的表达较强，其他研究报道了在非寄主香菜中，接种了病原菌后，苯丙氨酸氨裂解酶，4-香豆酸：辅酶A连接酶，S-腺苷基-L-甲硫氨酸，苯光甲烯O-甲基转移酶和病理反应相关蛋白的mRNA，在感染组织中上调。
研究报道称，在滴菌感染拟南芥与灰霉病菌后，基因DJ1E的拟南芥启动子，在整个拟南芥叶片中显示出类似的活性，这与结果一致，在研究中，其他基因，例如F-box-like基因07g056210.2.1和细胞色素P450，在八个取样位置中的两个位置上存在差异，当接种发生在顶尖叶片时。
这意味着选择的大多数取样位置与接种点类似地进行调节，因此在受感染的叶片的健康组织中，也可以感知到灰霉病的感染，有趣的是，这两个细胞色素P450的调节并不相同，这可以通过属于蛋白质超家族的细胞色素之间，潜在不同功能来解释。
结果表明，在顶尖叶片接种时，细胞色素P450和FAD结合域蛋白的mRNA，在叶轴和化合叶的顶尖叶，主叶脉中以相同的相对表达水平表达，当感染化合叶的侧叶片时，两个细胞色素P450，以及FAD结合域蛋白在叶轴样本和感染部位上以相似的方式表达，对于24和48小时的取样时间而言如此。
考虑到修正Ct值的差异，最强的上调总是在感染点处找到，为何基因的表达在接种点上有所不同，数据无法回答这个问题，由于所有四个在感染组织中，被描述为上调的基因在健康组织中也被上调，因此可以将这些基因的组合，用于多重qPCR检测无症状叶组织中的灰霉病感染。
建立这样的检测方法还需要进行进一步的实验，使用更大数量的样本，与使用选择性培养基的传统微生物疾病检测，和分离技术相比，这种方法可以快速指示患病叶样本，例如在番茄幼苗生产过程中。
如果这种基因调控是特定于灰霉病的，并且对其他生物和非生物胁迫的影响需要进一步评估，所呈现的结果建议取样叶轴组织，因为两个细胞色素P450以及FAD结合域蛋白的基因，在叶轴样本中与感染部位类似调控，而与感染位置无关。
是否在整株植物中也适用，还需要在未来的研究中进行测试，这些基因的启动子可能在工程改造植物方面具有进一步的用途，如葡萄藤中通过基因表达的非破坏性定量所示。
«——【·结论·】——»未受感染的花轴组织中存在灰霉病相关基因的上调现象，尽管程度较低，但这些基因在未受感染的组织中也表现出一定程度的上调，这暗示着这些基因的组合，包括花轴中上调的基因和参考基因，可以在多重qPCR检测中，用于检测无症状叶组织中的灰霉病感染。
需要进行更多样本的进一步实验来确立这种检测方法，与传统的微生物疾病检测和分离技术相比，这种方法可以更快速地指示患病叶样本，例如在番茄苗的生产过程中，仍然需要进一步研究这种基因调控是否特异于灰霉病，并评估其对其他生物和非生物胁迫的潜在影响。
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