文丨初八没烦恼编辑丨初八没烦恼盐生草是被子植物门，藜科，盐生草属，一年生草本植物。
主要分布于中国西北地区的山脚和戈壁滩，生长地区海拔为700~1000m。
由于盐生草的生长环境极端，易于遭受非生物胁迫的侵扰，因此其植株地上部分肉质化的叶片，和多分支的茎及地下部分茂密强壮的根系，使其拥有很强的耐盐抗旱能力。
耐盐机制中，根作为排盐器官，必须排除土壤溶液中溶解的大部分Na+和Cl-。
盐生草是典型的组织耐盐型盐生生物，其根系更是最先感知土壤盐分的组织器官，土壤里的大量盐分积聚在肉质的叶片中，然后区隔化于叶片中的液泡组织内。
Shaker型电压依赖性K+通道蛋白是由β亚基构成，通过控制K+进出细胞膜的流动以响应膜电位变化的四聚体膜蛋白，其中Kvβ1和Kvβ2的核心结构域是醛酮还原酶AKR。
醛酮还原酶蛋白超家族是一组以NADPH为辅因子，将醛、酮代谢为相应醇的酶。
实验的材料与方法试验所用盐生草种子取自盐碱地，均匀撒播于装有蒸馏水浸透培养基质的花盆中，花盆上覆保鲜膜并扎孔透气，放于人工气候室中培养。
每天浇灌适量Hoagland’s营养液保证培养基质的湿润状态，待幼苗长至2个月后，使用200mmol·L-1NaCl进行盐胁迫处理7d。
挑取长势强壮的盐生草根系，清洗消毒后使用天根植物总RNA提取试剂盒，提取盐生草根系RNA，使用天根反转录试剂盒反转录为cDNA，用作克隆的模板。
使用NCBIPrimer-BLAST，以盐生草根系HgAKR6C基因的蛋白质编码区序列，以及pBI121-eGFP、pYES2载体质粒上的多克隆位点。
分别设计含有酶切位点的特异性引物，HgAKR6C-F1、HgAKR6C-R1，HgAKR6C-F2、HgAKR6C-R2，分别进行构建亚细胞定位表达载体，和酵母异源表达载体。
使用NCBIPrimer-BLAST设计qRT-PCR引物HgAKR6C-q1F、HgAKR6C-q1R，HgActin为内参基因。
反应程序根据SuperReal荧光定量预混试剂两步法进行qRT-PCR检测：95℃预变性15min，95℃变性10s，60℃退火32s，40个循环。
反应体系：2×SuperRealPreMixPlus10μL、正反向引物各0.6μL、cDNA模板1μL、RNase-freeddH2O7.8μL。
设置3次技术重复，利用2-ΔΔCT法计算HgAKR6C基因在不同盐胁迫时间下的表达量。
实验结果分析本研究以200mmol·L-1NaCl处理一周的盐生草根系cDNA为模板，以HgAKR6C-F1、HgAKR6C-R1，HgAKR6C-F2、HgAKR6C-R2为引物进行PCR扩增。
扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳，验证片段大小后，进行胶回收纯化和再次电泳检测，得到与目的基因大小一致的条带，为951bp。
将目的条带胶回收产物连接pMD19-T、转化大肠杆菌及蓝白板筛选，以菌液为模板进行PCR扩增，成功扩增出目的片段，大小为951bp。
阳性菌液送公司测序，测序结果经DNAMAN9.0序列比对，显示同源性达100%，表明完整扩增出目的基因HgAKR6C。
提取克隆成功的目的基因的质粒，以及活化后的pYES2载体、pBI121-GFP质粒，HgAKR6C基因。
使用两种限制性内切酶双酶切跑胶验证后，通过T4连接酶构建载体，XbaⅠ、SmaⅠ双酶切构建pBI121-HgAKR6CGFP载体。
EcoRⅠ、XbaⅠ进行双酶切构建pYES2-HgAKR6C，转化大肠杆菌，挑取单克隆并做菌液PCR扩增，条带大小与目的基因一致。
测序后借助DNAMAN软件比对序列成功后，提取菌液质粒进行双酶切验证，条带大小与目的基因一致。
分析结果显示，HgAKR6C基因全长1657bp，最长开放阅读框为987bp，CDS区为951bp，编码317个氨基酸。
采用ProtParam预测HgAKR6C基因的理化性质，HgAKR6C编码蛋白的理论等电点值为6.25，属于酸性蛋白；分子量大小为35151.21Da，分子式为C1575H2473N419O468S12。
带负电荷残基数为36，带正电荷残基数为34；脂肪系数为90.41；不稳定系数为32.06，为稳定蛋白。
HgAKR6C基因编码的蛋白质的二级结构分析表明，占比最多的结构为α-螺旋，比例为52.68%。
其次是无规则卷曲，占25.87%，延伸链占14.2%，剩下的7.26%为β-转角，这与Swiss-Model预测的蛋白质三级结构结果相符。
TMHMM软件分析基因编码的蛋白的跨膜区得出，HgAKR6C基因无跨膜区，即该基因编码的蛋白属于非跨膜性蛋白。
分析结果显示，HgAKR6C基因存在信号肽的可能性为0.0038，推测HgAKR6C基因编码的蛋白不存在信号肽，不能引导新合成的蛋白质进入细胞或亚细胞器，属于非分泌型蛋白。
使用ProtScale分析蛋白疏水性，根据每一点的比值在0点以上判断为疏水性，在0点以下判断为亲水性，因此HgAKR6C编码蛋白为亲水性蛋白。
磷酸化位点预测结果显示，HgAKR6C基因编码的蛋白存在丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸磷酸化位点。
将pBI121-GFP与pBI121-HgAKR6C-GFP瞬时转化至烟草，使用激光共聚焦显微镜，观察基因在烟草细胞中的亚细胞定位。
pBI121-GFP空载体在烟草细胞中各个位置均表达，而pBI121-HgAKR6C-GFP主要在细胞质中观察到绿色荧光，少量分布于细胞核中，确定HgAKR6C基因在细胞质和细胞核中表达。
通过实时荧光定量分析，200mmol·L-1NaCl处理0、2、6、24、72h下，盐生草根系HgAKR6C基因的表达情况。
发现HgAKR6C基因，在盐胁迫2、6、24、72h处理下均有显著表达，表达量随着处理时间的延长呈先上升后下降的趋势，在24h时达到峰值后下降。
在AP培养基中K+浓度为1mmol·L-1、Na+浓度≤30mmol·L-1的情况下，将转化空载体和重组载体的菌液稀释1000倍时可明显看出，转化HgAKR6C基因的酵母菌株长势更好。
在AP培养基中K+浓度为1mmol·L-1、Na+浓度为50mmol·L-1的情况下，将菌液稀释10倍时可明显看出，转化HgAKR6C基因的酵母菌株长势，比转化空载体的菌株长势更好。
表明HgAKR6C基因的转入，减少了Na+对酵母细胞的毒害，说明HgAKR6C基因参与调控Na+的外排。
当AP培养基中K+浓度为10和100mmol·L-1时，转化空载体pYES2的酵母菌株与转化HgAKR6C基因的酵母菌株均能生长，在AP培养基中K+的吸收。
菌株生长环境中的Na+浓度对PYES2和AXT3-HgAKR6C中，Na+、K+含量具有显著影响；当酵母菌株生长环境中Na+浓度增大时，AXT3-HgAKR6C菌株体内K+、Na+含量均减少。
菌株生长环境中的K+浓度，对PYES2和CY162-HgAKR6C中，Na+、K+含量具有显著影响，当酵母菌株置生长环境中K+浓度增大时，CY162-HgAKR6C菌株体内K+含量增加而Na+含量减少。
实验结果讨论盐生草是获取植物耐盐基因的理想材料，实验对HgAKR6C基因编码的蛋白质进行生物信息学分析发现，HgAKR6C基因全长1657bp，CDS区全长951bp，编码317个氨基酸。
蛋白质磷酸化能够使蛋白质的活力发生变化，并且在生物体内的信号转导、生长发育方面发挥重要作用。
通过比较，鲁氏接合酵母的生理学与转录组学数据发现，盐胁迫导致酵母细胞内4种氨基酸含量显著增加。
利用磷酸化修饰蛋白质组学，对拟南芥模型进行分析，并发现一系列磷酸化位点，受高脱落酸诱导磷酸酶1的影响，以调节植物用于应对，非生物胁迫的信号传导和防御反应机制。
推测HgAKR6C基因编码蛋白包括3种磷酸化位点，可能通过非生物应激反应，或者蛋白质磷酸酶的去磷酸化作用，起到交叉保护或者信号调节的功能，以抵抗盐胁迫。
实验对盐生草根系基因HgAKR6C，在不同时间盐处理下的表达量进行分析，发现在盐处理24h时HgAKR6C具有最显著表达量，HgAKR6C基因编码蛋白的表达与盐胁迫有密切联系。
结构域预测结果显示，HgAKR6C基因编码蛋白含有AKR_SF超家族结构域，特定位点AKR_AKR6C1_2电压门控K+通道β亚基，分别来自拟南芥和水蕴草，分属于醛酮还原酶家族6成员C1和C2的初始成员。
而醛酮还原酶是一个大型的蛋白质超家族，主要是NAD依赖性氧化还原酶，参与羰基代谢，其主要目的是将醛和酮还原成一级和二级醇。
KCAB，也称为K+通道亚基，或KAB1，是一种可能的辅助K+通道蛋白，调节成孔α亚基的活性，与酮醛还原酶和K+通道蛋白具有一致的相关功能。
根据NCBI蛋白序列比对和结构域预测，本实验选取了现有的AKRs家族蛋白序列，构建系统发育进化树。
系统进化分析表明，HgAKR6C与拟南芥的AtAKR6C1亲缘关系最近，这与结构域预测的具有特定位点AKR_AKR6C1_2结果相符，因此推测HgAKR6C可能是属于AKR6C1家族的功能蛋白。
因此推断，HgAKR6C基因编码蛋白，是电压依赖型K+通道β亚基中，依靠AKRs作为辅助因子发挥耐盐胁迫的功能基因。
AXT3是一种对Na+敏感的酵母菌株，不含ATP酶，故对Na+极其敏感，CY162是一种K+缺陷型酵母菌株，不含K+转运蛋白TRK1、TRK2，在低钾条件下不能生长，二者常用于基因的初步验证。
根据研究结果可以合理预测，HgAKR6C是作用于细胞质上的稳定蛋白，具有AKR基因家族结构域且趋向于AKR6C1家族，通过Kvβ以维持离子稳态进而提高植株的耐盐性。
试验前期，盐生草盐胁迫转录组数据筛选，并克隆基因HgAKR6C，研究发现，该基因编码蛋白在细胞核和细胞质中均有表达。
结构域分析显示，HgAKR6C基因编码蛋白具有AKRs家族结构域，与系统进化分析中的AKR6C1家族蛋白序列具有高度同源性。
qRT-PCR结果显示，一定浓度盐胁迫可导致HgAKR6C的表达量增加。
通过构建酵母表达载体转入缺陷性菌株显示，该基因具有使Na+外排和K+转运的功能，确定HgAKR6C可作为盐生草根系耐盐基因调控机制的研究对象，为后期HgAKR6C的功能分析提供了理论依据。