在阅读文章之前，请您点击一下“关注”，既方便您讨论与分享，又能给您带来不一样的参与感，感谢您的支持。
文丨王律法谈编辑丨王律法谈前言香葱在中国南方地区周年普遍栽培，味辛香，鲜食、加工、观赏、药用兼用，是日常必不可少的重要调料。
香葱性喜冷凉，而南方地区夏秋高温，高温极易造成葱管褪绿、葱尖干黄、葱白腐烂、组织老化和纤维增多、病害频发甚至绝收等现象。
高温胁迫通过影响生物膜流动性、蛋白构象改变、热激蛋白积累等对蛋白功能及代谢功能产生影响，热激蛋白家族表达通常会提高植物耐热性。
热激蛋白家族广泛存在于原核生物、真核生物、古细菌及病毒中，通常分为HSP100、HSP90、HSP70、HSP60和sHSP5个家族，在细胞质、线粒体和叶绿体中均有发现。
DnaJ蛋白又称HSP40或J蛋白，是热激蛋白Hsp70s辅助分子伴侣蛋白家族，具有独自或协助热激蛋白的功能，可激活HSP70的ATP/ADP的活性，协同完成对底物蛋白的ATP依赖的结合和释放，调节目的蛋白折叠、组装与解聚等。
从热激蛋白家族基因着手研究香葱耐热性，分析DnaJ在香葱高温胁迫响应中的作用，对香葱耐热抗性基因挖掘，选育高抗新品种，探明香葱抗高温胁迫的分子调控机制和促进产业可持续发展具有重要的意义。
与其他植物等相比，在香葱中与耐热抗逆相关的基因功能研究均相对落后，本研究从香葱转录组数据库中获得DnaJ序列，利用5'RACE和3'RACE技术从香葱中扩增了DanJ基因的5'端和3'端序列。
拼接后获得该基因的全长cDNA序列，对其全序列进行了生物信息学分析、进化树分析，并通过烟草顺瞬时转化进行亚细胞定位，检测其高温胁迫下表达情况，本研究将为解析热激蛋白家族基因AfDanJ在香葱高温响应的生物学功能提供参考。
材料及处理试验香葱耐热种质为AF60、不耐热种质为AF35，保存于蔬菜研究所科研展示大棚，取长势一致的1年生假茎移栽至花盆缓苗，5株/盆，正常管理。
待香葱生长至商品成熟转移至人工气候箱中，进行适应培养1周，而后进行高温处理，分别于处理0h、12h、24h、48h、72h选取相同位置的收集香葱叶片。
使用液氮速冻并保存于−80℃冰箱于后期备用，设置3个生物学重复，随后采用Trizol法RNA提取试剂盒提取香葱总RNA，置于-80℃冰箱保存。
根据香葱转录组数据中DnaJ序列，设计5'RACE和3'RACE引物，参照说明书将抽提的总RNA进行cDNA第一链合成，将5'RACE和3'RACE二轮PCR产物分别进行电泳，对目的片段的回收与连接，连接产物转化感受态细胞，挑取阳性菌落并进行测序。
香葱AfDanJ基因的克隆以香葱AF60转录测序的香葱DnaJ序列，设计5'RACE和3'RACE引物，分别获得基因3'端片段和5'端片段，电泳检测结果显示扩增产物条带清晰，长度分别为300bp与190bp，测序正确后，利用软件将克隆获得基因5'端序列和3'端序列与保守区序列拼接获得基因全序列。
通过NCBI中BLAST对序列进行比对分析，预测获得该基因氨基酸序列与已报告的南欧蒜的DNJH2ALLPO家族成员99%相似，含有1257bp的完整开放阅读框，故将该基因命名为AfDanJ。
香葱AfDanJ基因生物信息学分析根据在线预测蛋白理化特性发现蛋白含418个氨基酸，分子量大小46811.64D，理论等电点为6.10，蛋白质的不稳定指数为37.06，表明其为稳定性蛋白。
而脂肪系数为57.85，亲水性平均系数为-0.860，表明其为亲水蛋白。
利用软件预测蛋白疏水性，发现蛋白出现峰值为0.858，位于第285位点，表明该位点疏水性最强，在第398位点，出现最低值为-2.758，其亲水性是最强。
随后进行三级结构预测，目的蛋白与模板对比GMQE为0.83，SeqIdentity为94.98%，预测可信该蛋白具有明显的DnaJ蛋白家族结构域的特征。
香葱AfDanJ基因进化分析下载同属近源物种序列，比对香葱AfDanJ与5个近源植物的DanJ进化关系，结果表明：香葱DanJ与芦笋最先聚为一类，同源性最高，而和韭葱的进化关系较远。
利用激光共聚焦显微镜观察绿色荧光蛋白的分布情况，发现对照2300-GFP在细胞核和细胞质中均观察到绿色荧光信号，而AfDanJ-2300的荧光信号主要分布于细胞核、细胞膜、叶绿体中，该基因定位于细胞核、细胞膜、叶绿体。
香葱AfDanJ基因在高温处理下的表达为研究AfDanJ基因表达是否受高温胁迫的影响，通过实时定量技术，检测耐热AF60及不耐热AF35香葱植株中AfDanJ基因在高温不同时间处理下的表达情况。
在高温胁迫后24h、48h、72h后，AF60AfDnaJ的表达量比未处理0h的基因表达量分别增加了1.9倍、1.9倍和3.1倍，而在不耐热品种AF35中，AfDnaJ表达量较低，且随着热处理时间增加，基因表达水平没有明显变化。
表达载体构建基因片段进行PCR扩增，电泳检测，胶回收基因片段，表达载体使用限制性内切酶SacI和XbaI双酶切，同源重组法构建过表达载体总体系：线性化载体1μL，基因片段胶回收产物5μL，重组酶1μL，5×反应缓冲液2.0μL，ddH2O1μL。
反应程序：50℃20min，反应产物转大肠杆菌感受态DH5α，含卡那霉素固体LB培养基培养，大肠杆菌菌液PCR检测。
活化农杆菌，将同源重组法构建的表达载体导入农杆菌感受态，将菌检正确的菌液置于含卡那霉素的液体LB培养基中：28℃、200r/min培养20h，之后进行菌液扩大培养。
最终悬浮菌液为0.5~5.0mL，OD600为0.4室温静置3h，侵染前将烟草放于白色荧光灯下1h，用1mL针管注射器在本氏烟草叶片的背面缓慢注入菌液，并标记。
将注入菌液后的烟草重新放回培养室恢复培养2~3d，在FV10-ASW激光共聚焦显微镜观察亚细胞定位。
采用试剂盒进行实时定量PCR，选择盐香葱Actin基因作为内参基因，反应程序为：95℃预变性2min，95℃变性5s，60℃退火30s，共40个循环。
植物通过热激反应响应高温胁迫，研究表明热激蛋白、热激转录因子、光合系统、钙调蛋白、泛素连接酶基因、脂肪酸去饱和酶、胆碱氧化酶等基因参与的植物响应高温胁迫。
其中，热激蛋白家族在作物抵抗高温耐热性方面居于核心地位，具有重要作用，研究人员发现HSP70在经过热激处理的大豆幼苗的叶、茎和根中均有表达，表达水平在热处理后至少增加了2倍。
叶用莴苣热激蛋白基因LsHsp70-2711在耐热品种中表达量高于热敏品种，DnaJ蛋白是热激蛋白Hsp70s辅助分子伴侣蛋白，目前在拟南芥、水稻、棉花、辣椒中均有关于DnaJ家族的研究报道。
随后便发现黄瓜9个DnaJ基因皆出现上调表达趋势，且与对照组基因表达量具有显著性差异，本研究发现，热激蛋白家族AfDnaJ参与到香葱高温分子响应中，表达水平在热处理后增加3.1倍，而在不耐热品种中表达不上调，与前人研究一致。
总结在基因性质方面，发现在辣椒中CaDNAJE基因家族有28个成员，氨基酸序列长度为99~470aa，分子量为10.05~52.26kD，理论等电点为4.75~9.64，编码蛋白主要定位在叶绿体和细胞核中。
在黄瓜中CsDnaJ基因所编码的蛋白序列长度为113~2551aa，完整J结构域核心区序列至少含有1个，在本研究中香葱AfDanJ基因具有1257bp，相对分11子质量约46584.45，与前人研究结果相近。
在亲缘关系方面，香葱AfDanJ基因与芦笋亲缘关系更近，可能与本试验使用转录组数据库比对为芦笋有关。
最终香葱AfDanJ基因具有1257bp的完整开放，等电点为5.05，与芦笋亲缘关系最近，定位于细胞核、细胞膜、叶绿体中，该基因在提高耐热香葱品种的耐热性方面发挥重要作用。