编译：微科盟公虾米，编辑：微科盟Tracy、江舜尧
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导读西洋参是一种富含人参皂苷类化合物和多糖类化合物等生物活性成分的天然同源药物和食品
该研究首次将超高效液相色谱四极杆/飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF/MS）和解吸电喷雾质谱成像（DESI-MSI）结合，并应用于空间代谢组学分析，我们全面评估了西洋参植物根的不同微区的差异成分
UPLC-Q-TOF/MS 和 DESI-MSI 与主成分分析和正交偏最小二乘判别分析相结合，用于筛选差异代谢物
UPLC-Q-TOF/MS和DESI-MSI分别筛选出27种和23种差异代谢物，其中15种差异代谢物被两种方法鉴定
研究发现，人参皂苷 Rg1 和丙二酰基人参皂苷 Rc 等成分主要分布在西洋参根横切面的 P 部分（外围微区），而人参皂苷 Ro 和丙二酰人参皂苷 Rd 主要分布在西洋参根横切面的 C 部分（中心微区）
本研究的方法和结果可用于了解西洋参中特殊代谢物的精确定位、生物合成和生物功能
亮点：1.空间代谢组学揭示西洋参根的微区中成分差异
2.UPLC-Q-TOF/MS与DESI-MSI相结合的代谢组学研究
3.不同化学成分在西洋参中的分布不同
4.未知的化学成分可以通过DESI - MSI进行可视化
论文ID原名：Spatial metabolomics method to reveal differential metabolomes in microregions of Panax quinquefolius roots by using ultra-performance liquid chromatography quadrupole/time of flight-mass spectrometry and desorption electrospray ionization mass spectrometry imaging译名：基于超高效液相色谱四极杆/飞行时间质谱和解吸电喷雾质谱成像技术的空间代谢组学方法揭示西洋参微区代谢组差异期刊：Food chemistryIF：8.8发表时间：2023.10通讯作者：张艺，邝婷婷，唐策通讯作者单位：成都中医药大学实验设计实验结果1. 利用 UPLC-Q-TOF/MS 对西洋参进行分析本研究采用UPLC-Q-TOF/MS快速分离鉴定了西洋参中C和P微区的主要化学成分（图1a）
我们分别对30℃、35℃和40℃的色谱柱温度进行了优化
结果表明，当色谱柱温度为 40 ℃时，仪器压力值更低，分析速度更快
我们使用 UPLC 在优化后的梯度流动相中进行洗脱，结果表明在 18 分钟内可快速分离样品
我们还对色谱和光谱条件进行了优化，以达到快速分离和检测主要化学成分的目的
在前期实验和文献报道中，负离子模式比正离子模式对检测西洋参中的化学成分反应更灵敏
因此，我们在负离子模式下对化合物进行了电喷雾电离
此外，我们还在流动相中加入了甲酸，以改善色谱图的峰形，并生成甲酸加合物 [M + HCOO]-，用于检测和确认分子离子
优化条件后得到的基峰色谱图如图 2 所示
表 1 总结了所鉴定化学成分的保留时间、分子式、理论分子质量、检测到的分子质量和质谱碎片
所有鉴定出的分子离子的质量数误差都在± 5 ppm以内，表明检测到的分子离子与理论分子离子吻合良好
图1 DESI-MS 成像实验工作流程
(a) 制备西洋参样品的流程图，外围微区（P）由木栓层、韧皮部和形成层组成，中心微区（C）由髓部和木质部组成；(b) DESI-MSI 处理过程
图2 在负离子模式下，通过 UPLC-Q-TOF/MS 分析西洋参 P微区（外围微区）和 C微区（中心微区）的代表性基峰强度 (BPI) 色谱图
表1 在负离子模式下通过 UPLC-Q-TOF/MS 分析西洋参 61 个标志峰的化学成分信息a 根据标准品进行鉴定
Glc：β-D-吡喃葡萄糖基；Xyl：β-D-吡喃木糖基；Rha：β-D-鼠李糖；Ac：乙酰基；GluA：葡萄糖醛酸；Ara：α-L-吡哺阿拉伯糖；Araf：α-L-阿拉伯呋喃糖基；Mal：丙二酰单酰
西洋参的化学成分极为复杂
目前，研究人员已从这些不同人参品种中分离和鉴定出数百种化学成分，其中人参皂苷是主要的化学成分
此外，许多研究都报道了多种不同类型人参皂苷的裂解途径，这为本研究使用 UPLC-Q-TOF/MS 检测和鉴定这些代谢物提供了便利
在质谱图中，负离子模式下大部分人参皂苷主要表现为甲酸加合物[M + HCOO]-
在 MS/MS 图谱中，我们发现了两种质子化离子[M-H] -和甲酸加合物[M + HCOO]-
两种加合离子之间的差值为 46 Da，因此，人参皂苷的准分子离子更容易测定
然而，丙二酰基人参皂苷不能产生加合物离子[M + HCOO]- ，因为丙二酰基人参皂苷不稳定
在负离子模式下的人参皂苷 MS/MS 图谱中，这些成分的碎片离子裂解模式与糖苷单元的连续或同时损失相对应，如葡萄糖（Glc）基团（162 Da）、鼠李糖（Rha）基团（132 Da）、木糖（Xyl）/阿拉伯糖（Ara）基团（132 Da）和葡萄糖醛酸（GluA）基团（176 Da）
通过比较其保留时间和碎片离子，并结合参考材料和相关参考文献，图 2 中确定了西洋参中的 61 种主要化学成分，其中包括 24 种原人参二醇型皂苷（峰 14、21、24、33、35、37、39、40、41、43、44、45、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、58、59）、20 种原人参三醇型皂苷（峰 6、7、9、10、11、12、13、 15、16、17、18、19、20、22、23、25、30、31、32、38），6 种齐墩果烷型皂苷（峰 27、34、36、42、46、57），3 种奥克梯隆型皂苷（峰 8、28、29），以及 8 种其他类型化合物（峰 1、2、3、4、5、26、60、61）
如图 2 所示，在C微区中，竹节参皂苷 IV（峰42）、竹节参皂苷 II（峰46）、人参皂苷 Rd（峰47）、丙二酰基人参皂苷 Rd（峰48）、绞股蓝皂苷 XVII（峰49）和 20（R）-人参皂苷 Rg3（峰56）的含量均高于 P微区， 而 P微区中乙酰基人参皂苷 Rg1 (峰22)、人参皂苷 ROA (峰27)、majonoside R2 (峰28)、屏边三七皂苷 R2 (峰34)、人参皂苷 Rc (峰35)、丙二酰基人参皂苷 Rc (峰37)和 3-乙基-3-羟基-5α-雄甾烷-17-酮 (峰61) 的含量高于 C 微区中的含量
2. 基于 UPLC-Q-TOF/MS 的标志物分析2.1 PCA 和 PLS-DA分析我们利用12批次西洋参C微区和P微区样品的负离子模式全扫描质谱数据进行非靶向代谢组学研究，使用 Progenesis QI 提取了 18 批样品（包括 6 批质控样品）的保留时间、m/z 和归一化丰度信息
处理后的原始剖面数据被导入 SIMCA 软件进行多元统计分析
如图 3 所示，质控样品紧密聚类，反映了系统令人满意的稳定性
根据 PCA 结果可知，不同微区之间的明显分离表明其化学成分是不同的，我们建立的 PCA 模型的 R2 X 和 Q2 值分别为 0.74 和 0.326，表明该模型的性能是可以接受的
对于 PLS-DA（R2 X = 0.549，R2 Y = 0.95，Q2 = 0.667），我们发现两组之间有明显的区别，这与 PCA 的结果一致
这些数据表明，PCA 和 PLS-DA 模型的预测能力是可以接受的
2.2 西洋参根不同微区的标志物发现我们建立 OPLS-DA 模型的目的是发现不同的化学成分，并验证造成主要差异的化合物
P 微区和 C微区被分为两个不同的组，显示出化学成分的多样性
R2 Y 和 Q2 值分别为 1 和 0.967，证实了该模型具有良好的解释和预测能力
在相应的 S-图中，远离原点的离子表示对 P 微区和 C 微区之间的分离起了重要作用，可将其视为西洋参植物根不同微区部分的鉴别代谢物
我们将这些发现与 VIP 值（VIP > 1）的结果相结合，可以筛选出相应的标志物
我们共鉴定出 27 种差异代谢物，详细信息见补充表 S1
此外，我们还利用热图对这些差异代谢物的相对含量进行了可视化分析
如图 3c 所示，27 种差异代谢物的含量在P 微区和 C 微区之间存在差异，其中 13 种代谢物在 C 微区中含量较高，而另外 14 种代谢物在 P 微区中含量较高
图3 基于 UPLC-Q-TOF/MS 数据集的西洋参P微区（外围微区）和 C微区（中心微区）代谢分析
(a) PCA 得分图
(b) PLS-DA 得分图
(c)西洋参不同微区中 27 种化学标志物的半定量结果热图
蓝色方框表示标志物相对含量较低，红色方框表示标志物相对含量较高
3. 利用 DESI-MSI 原位分析西洋参根中的代谢物特征3.1 西洋参不同微区的 PCA 和 PLS-DADESI-MS 成像流程见图1b
我们利用 DESI-MSI 获得了高质量的原始文件，并通过 HDI 软件选择了 32 个区域
这些区域的 m/z 和归一化丰度信息数据矩阵被用于 PCA 和 PLS-DA分析，以区分西洋参植物根的不同微区
PCA 得分图（R2X = 0.869 和 Q2 = 0.714）（图 4a）显示，各微区的主成分方向差异显著，表明两组可以区分
PLS-DA 判别（R2X = 0.703，R2Y = 0.996，Q2 = 0.96）（图 4b）与 PCA 模型一致
3.2 用于识别西洋参不同微区的标志物DESI-MSI的PCA和PLS-DA结果表明，西洋参C微区和P微区的化学成分不同
因此，我们对西洋参根横切面上的C微区和P 微区进行 OPLS-DA分析，以揭示其代谢标志物
C微区和P微区的化学成分信息发生分离，表明西洋参植物根C微区和P 微区的化学成分存在显著差异
我们利用 S-图加载得分图，远离原点的离子对P 微区和 C微区的分离有显著作用，同时结合 VIP > 1，可以筛选得到相应的差异代谢物
我们利用自建数据库、在线数据库（如 SciFinder）和上述 LC-MS 分析结果，确定了这些代谢物的化学结构
我们共筛选出 23 种差异代谢物，详情见补充表 S2
所有 23 种差异代谢物，包括 5 种未确定的差异代谢物，都使用 DESI-MSI 进行了可视化分析（图 4c）
此外，我们还使用热图来评估 23 种差异代谢物的相对含量
如图 4c 所示，聚类热图显示了两个微区之间差异代谢物的不同含量
红色方框表示的含量较高，蓝色方框表示含量较低
总体而言，P 微区和 C 微区分别聚类，这与之前的PCA 和 PLS-DA 结果一致
图4 基于 DESI-MSI 数据集的西洋参P（外围微区）和 C（中心微区）代谢分析
(a) PCA 得分图
(b) PLS-DA 得分图
(c)西洋参根不同微区中 23 种化学标志物的半定量结果热图
蓝色方框表示相对含量较低，红色方框表示相对含量较高
3.3 西洋参根中 DESI-MSI 标志物的空间分布通过 DESI-MS，我们将23 种差异代谢物在不同微区的位置进行了可视化
大多数西洋参标志物显示出特异性的定位和不同的相对含量（图 5）
西洋参的标志物分布与其分子量有关，大部分标志物存在于西洋参根的P微区部分，尤其是分子量较大的标志物，包括人参皂苷 Rb1（峰32，m/z 1153.6055）、丙二酰基人参皂苷 Rc/Rb2/Rb3（峰37/43/44，m/z 1163.5895）、乙酰基人参皂苷 Rg1（峰22，m/z 841.4972）、丙二酰基人参皂苷 Rg1（峰18，m/z 885.4873）和人参皂苷 Rg1/假人参皂苷 F11（峰16/29，m/z 845.4922）
人参皂苷 Rb1/Rb2/Rc/Rb3 在木栓层中的含量明显高于木质部，这与本研究中 DESI-MSI 的结果一致
C 微区中其他 13 种代谢物的相对含量高于 P 微区
因此，我们在图 5 中将这 13 种代谢物进行集中显示
DESI-MSI 还显示了 5种未知代谢物（图 5），这 5 种未知代谢物在 C 微区和 P 微区中的分布也不同
图5 利用 DESI-MSI（负离子模式）对西洋参中不同微区的不同标志物进行定位
4. 不同微区差异标志物的 DESI-MSI 和UPLC-Q-TOF/MS 检测方法比较代谢组学可用于快速筛选植物不同微区的差异代谢物
本研究分别采用 UPLC-Q-TOF/MS 和 DESI-MSI 对西洋参根横截面不同部位进行了空间代谢组学分析
结果表明，皂苷是不同微区的主要差异代谢物
我们在LC-MS检测结果中筛选出 27 种可区分 P 微区和 C 微区的代谢物，如 14种原人参二醇型皂苷 (PPDs)、5 种 原人参三醇型皂苷(PPTs)、2 种奥克梯隆型皂苷(OTs)和 5 种齐墩果烷型皂苷( OAs)；其中，14 种代谢物的相对含量在 P 微区较高，另外13 种代谢物的相对含量在 C 微区较高
我们在 DESI-MSI 检测结果中筛选出了 23 种代谢物（包括 5 种未识别成分）可以区分 P 微区和C 微区，包括 7 种 PPDs、4 种 PPTs、4 种OAs 等
其中，8 种代谢物的相对含量在 P 微区较高，另外 15 种代谢物的相对含量在 C 微区较高
如上所述，两种方法鉴定出的代谢物大多相同，15 种标志物（峰16、19、22、32、33、34、36、 42、44、45、46、48、49、55、56）是两种方法筛选出的共有标志物
其中，原人参二醇型人参皂苷的含量在 P 微区中高于 C 微区
DESI-MSI 分析还表明，皂苷含量在韧皮部和木栓层中较高，这与人参皂苷在外围微区比中心微区多积累的结果一致
木栓层和韧皮部中人参皂苷的高度富集符合植物次生代谢物理论，即次生代谢物通常是植物在恶劣环境中生存的植物防御调节剂
此外，DESI-MSI证实了人参皂苷在西洋参根横切面空间上的差异性分布，表明了西洋参根中代谢物具有组织特异性
前期有研究报道，西洋参根组织中的转录本表达也具有组织特异性；例如，与皂苷含量相关的 CYP 和 UGT 转录本可以调控皂苷的分布
因此，某些转录组的表达可能参与调控西洋参根次生代谢产物的分布
与LC-MS相比，DESI-MSI为代谢组学提供了一种更简单、更快速的方法
DESI-MSI通过检测切片表面的分子离子获得相关的化学信息，并通过成像软件拟合出切片的分子成像图，从而快速定位切片中的分子
同时，DESI-MSI 的分辨率可达 100 μm 甚至更高
DESI-MSI 所需的样品制备较少
由于 DESI-MSI 的原位空间优势，其分析样品和成分无法分离，无法准确区分异构体是其主要缺点
与 DESI-MSI 不同，LC-MS 具有更强的分离和分析能力
然而，LC-MS 的样品制备过程复杂且耗时，提取过程中所需的介质也会导致次生代谢物的空间信息不准确
在本研究中，DESI-MSI 鉴定出的α-麦芽糖（峰2）/蔗糖（峰3）等一些代谢物分布在整个根部，表明其含量很高
多糖是西洋参的主要活性成分，特异多糖的含量可高达 9.9-13.3 mg/g
不过，LC-MS 中的差异代谢物没有被筛选出来，这可能是由于本研究中提取样品的溶剂使用的是 70% 的甲醇
此外，西洋参根中糖的含量很高，而糖在70% 的甲醇中无法完全溶解
利用DESI-MSI获得的空间信息可以评估西洋参植物根不同组织中的生物活性
这两种方法的优势可以结合起来研究植物的次生代谢物，从而建立化合物分布与植物结构和功能的相关性
结论我们利用UPLC-Q-TOF/MS对西洋参中的化学成分进行了研究，从西洋参外围微区和中心微区中鉴定出61种主要化学成分，并将UPLC-Q-TOF/MS和DESI-MSI与PCA、PLS-DA和OPLS-DA相结合进行代谢组学研究
具体而言，UPLC-Q-TOF/MS 筛选出 27 种差异标志物，DESI-MSI 鉴定出 23 种差异标志物
此外，DESI-MSI 还表征了 23 种标志物的空间分布
DESI-MSI可作为代谢组学研究的一种新手段，提供组织结构与单个代谢物之间的直接联系，为了解次生代谢物和生物功能提供线索
DESI-MSI和UPLC-Q-TOF/MS获得的结果可用于了解西洋参植物中特殊代谢物的精确定位、体内生物合成和生物功能