摘要Metabolic networks are interconnected and influence diverse cellular processes. The protein-metabolite interactions that mediate these networks are frequently low affinity and challenging to systematically discover. We developed mass spectrometry integrated with equilibrium dialysis for the discovery of allostery systematically (MIDAS) to identify such interactions. Analysis of 33 enzymes from human carbohydrate metabolism identified 830 protein-metabolite interactions, including known regulators, substrates, and products as well as previously unreported interactions. We functionally validated a subset of interactions, including the isoform-specific inhibition of lactate dehydrogenase by long-chain acyl–coenzyme A. Cell treatment with fatty acids caused a loss of pyruvate-lactate interconversion dependent on lactate dehydrogenase isoform expression. These protein-metabolite interactions may contribute to the dynamic, tissue-specific metabolic flexibility that enables growth and survival in an ever-changing nutrient environment.代谢网络相互关联，影响着多种细胞过程
介导这些网络的蛋白质与代谢物之间的相互作用通常亲和力较低，难以系统地发现
我们开发了质谱与平衡透析相结合的系统发现异构体（MIDAS）技术，以确定此类相互作用
通过对人类碳水化合物代谢过程中的 33 种酶进行分析，发现了 830 种蛋白质与代谢物之间的相互作用，其中包括已知的调节因子、底物和产物，以及以前未报道过的相互作用
我们从功能上验证了一部分相互作用，包括长链酰基辅酶 A 对乳酸脱氢酶同工酶的特异性抑制作用
这些蛋白质与代谢物之间的相互作用可能有助于组织特异性的动态代谢灵活性，从而使细胞能够在不断变化的营养环境中生长和存活
实验结果1MIDAS 平台检测 PMI代谢物是代谢途径中的小分子底物、中间产物和终产物，它们与蛋白质的相互作用也将代谢状态传递给不同的细胞过程（图 1A）
这种共价和非共价的调控相互作用使细胞行为适应动态的营养供应和代谢需求
蛋白质-代谢物相互作用（PMIs）的鉴定一直很零散，发现这种相互作用的策略也很有限
目前已经取得了一些进展，但许多蛋白质代谢物相互作用的性质使其识别变得复杂
例如，为了最大限度地发挥动态调控潜力，代谢物经常以接近其细胞浓度的亲和力与其靶蛋白相互作用--通常是低微摩尔到低毫摩尔
因此，作者开发了高灵敏度质谱结合平衡透析系统发现异构体（MIDAS）平台，以便系统发现 PMIs，包括低亲和力和高亲和力的相互作用
MIDAS 利用了平衡透析的生物物理原理（图 1B）
简而言之，纯化的蛋白质通过半透膜与确定的代谢物库分离，半透膜允许代谢物扩散，但不允许蛋白质扩散
培养后，系统达到相对平衡，这样在蛋白质室和代谢物室中游离（即非相互作用）代谢物的浓度相似（图 1B，灰色轮廓符号）
然而，与蛋白质相互作用的代谢物在蛋白质室中的总浓度要高于或低于代谢物室，这取决于结合亲和力和相互作用模式（图 1B，洋红色三角形和黄色星形）
然后将蛋白质变性并从蛋白质室中取出，并通过高通量流动注射分析-质谱法（FIA-MS）量化两个室中所有代谢物的相对丰度
测定两室之间的折叠变化，然后进行归一化和校正，以消除非特异性相互作用
正折叠变化表明存在直接的 PMI，并取决于相互作用的结合亲和力
负的折叠变化可能是由于代谢物的酶转化反应速度快于跨膜扩散速度
在蛋白质变性过程中未被破坏的共价和非共价 PMI 也会产生负折叠变化，因为代谢物会随蛋白质一起被移除
MIDAS 代谢物库包括 401 种化合物，这些化合物代表了人类代谢组中相当一部分水溶性、化学性质稳定、FIA-MS 可检测且可在市场上买到的成分
由于化学结构和电离特性的内在差异，并非所有代谢物都能用相同的 FIA-MS 参数进行分析
作者单独分析了每种代谢物的最佳 FIA-MS 电离和检测条件，并在这些标准的指导下，将文库分为四个池进行多重分析
作者开发了快速 FIA-MS 方法，并针对每个库进行了优化，从而能够对组成代谢物进行定量分析
作者利用具有特征明确的代谢物相互作用蛋白进行了试验验证研究
作者分析了三种调节雷帕霉素复合体 1（mTORC1）机制靶标的人类蛋白质：mTORC1 亚基 1 的细胞膜精氨酸传感器（CASTOR1），它与精氨酸结合；Sestrin2，它与亮氨酸、异亮氨酸和蛋氨酸结合；以及 Rheb，它将三磷酸鸟苷（GTP）水解为二磷酸鸟苷（GDP）
在每种情况下，这些蛋白质的已知代谢物配体都是检测到的最富集的相互作用物（图 1，C 至 E）
除了已知的相互作用外，还发现多胺衍生物（1,3-二氨基丙烷、阿加马汀和尸胺）与 CASTOR1 和 Sestrin2 结合，这表明可能存在反馈调节，因为 mTORC1 通路会促进某些癌症中多胺的合成
因此，MIDAS 有效地确定了已知的多胺调节因子、底物和产物
实验结果2MIDAS 系统揭示了整个碳水化合物代谢过程中途径间和途径内的相互作用碳水化合物代谢酶驱动着大部分细胞能量的产生和生物合成前体的生成，而且已知它们受代谢物相互作用的调控
因此，作者利用 MIDAS 分析了 33 种人类酶，它们横跨糖酵解、葡萄糖生成、三羧酸（TCA）循环以及从糖酵解分支的丝氨酸生物合成途径
作者总共鉴定出了 830 个推定的 PMIs，其中许多是以前未知的
PMI 数据集的无监督分层聚类（图 2，A 至 D）和多维缩放（图 2E）表明，结构和功能相关的蛋白质经常有类似的代谢物相互作用
例如，磷酸甘油酸突变酶 1 和 2（PGAM1 和 PGAM2）、烯醇化酶 1 和 2（ENO1 和 ENO2）、果糖-1,6-二磷酸酶 1 和 2（FBP1 和 FBP2）以及乳酸脱氢酶 A 和 B（LDHA 和 LDHB）都与其同工酶密切相关
然而，在所有酶同工酶和同工酶中并没有观察到这种情况，考虑到不同的进化使得代谢功能和调节方式各不相同，尤其是反映在细胞类型特异性同工酶表达中时，这种情况也是意料之中的
例如，丙酮酸激酶肌肉同工酶 1（PKM1）主要在成人组织中表达，而丙酮酸激酶肌肉同工酶 2（PKM2）则在胎儿组织和许多癌细胞中表达
PKM1 和 PKM2 与代谢物相互作用组的差异可能反映了它们特定的、依赖于环境的功能和调控
此外，异柠檬酸脱氢酶同工酶（IDH2 和 IDH3）催化类似的化学反应，但在进化和结构上并不相关，它们表现出不同的代谢物相互作用组
作者观察到多种依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）的脱氢酶聚集在一起：甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）、LDHA、LDHB、线粒体苹果酸脱氢酶（MDH2）和 3-磷酸甘油酸脱氢酶（PHGDH），这表明酶反应类别可以驱动蛋白质-代谢物相互作用组（图 2E）
结构和功能相关的代谢物也有类似的聚集，包括含烟酰胺的代谢物和黄素腺嘌呤二核苷酸（图 2B）、含磷酸的有机酸（图 2C）和几种单磷酸核苷酸（图 2D）
对 MIDAS 平台鉴定出的 830 个推定 PMIs 的分析表明，碳水化合物与碳水化合物代谢酶的相互作用数量最多（图 2F）
这可能反映了底物-产物关系以及上游或下游代谢物对这些酶的异位或正位调节（即前馈和反馈调节）
大多数非碳水化合物 PMI 涉及氨基酸、核苷酸和脂肪酸衍生物
这些 PMIs 不仅代表了这些途径中酶的底物和产物，而且可能揭示了碳水化合物代谢的途径内和途径间调控（图 2G）
由于 MIDAS 是一个体外平台，缺乏在体内发现的细胞内分区，一些假定的 PMIs 预计不会在完整细胞中出现；然而，鉴于蛋白质和代谢物细胞内定位的生理可塑性，这类 PMIs 不一定会被忽视
作者使用费雪精确检验将 MIDAS 数据与 BRENDA 和 Recon3D 数据库中先前报告的 PMIs 进行了比较，发现 MIDAS 显著鉴定了已知底物和产物（P < 2.0 × 10-12）以及激活剂和抑制剂（P < 4.7 × 10-8）
我们认为，这些 MIDAS 数据提供了碳水化合物代谢中局部和远端代谢信息整合的详细视图
实验结果3代谢物与烯醇酶和富马酸酶相互作用的结构分析作者选择了一部分 PMIs 进行更深入的生物信息学、生物化学和结构分析
烯醇化酶催化糖酵解的倒数第二步，两种同工酶（ENO1 和 ENO2）富集最多的代谢物是磷酸丝氨酸（pSer）（图 3A）
丝氨酸可异位激活 PKM2，PKM2 是烯醇化酶下游的酶
差示扫描荧光测定法（DSF）可测量配体结合后蛋白质热稳定性的变化，它显示 pSer（而非丝氨酸、磷酸酪氨酸或磷酸盐）可稳定 ENO1 [表观解离常数（KD app）= 1. 38 mM] 和 ENO2（KD app = 1.15 mM）（图 3B），其亲和力与底物 2-磷酸甘油酸（2PG）（KD app = 0.298 mM 和 0.289 mM）相似
pSer-ENO2 复合物的 X 射线晶体学显示，pSer 在两个活性位点之一与 ENO2 二聚体不对称结合，并与 2PG 磷酸结合位点部分重叠（图 3，C 和 D）
此外，相对于底物结合的复合物，pSer 促进了活性位点的开放构象，可观察到环 4 和 11 以及 α 螺旋 7 和 11 的重新定位（图 3D）
因此，这一结合事件可能会调节烯醇酶的其他活性，如其月光功能之一
作者发现 2-氨基-3-膦酰基丙酸（AP-3）是膦酸代谢的一种成分，也是 3-膦酰基丙酮酸的反式产物，它可能与富马酸酶有相互作用，富马酸酶是 TCA 循环中的一种酶，可催化富马酸与苹果酸的可逆水合作用（图 3E）
AP-3 诱导的富马酸酶热稳定性（KD app = 0.98 mM）与其底物富马酸（KD app = 3.87 mM）相似（图 3F）
动力学测定表明，AP-3 对富马酸酶具有竞争性抑制作用，与此相一致的是，复合物的晶体结构显示 AP-3 与已知抑制剂柠檬酸相似，结合在富马酸酶的活性位点上（图 3，G 和 H）
虽然在人体组织中检测到了 AP-3，而且它在微生物代谢中无处不在，但人们对 AP-3 在人体中的代谢以及 AP-3 对富马酸酶的调节作用知之甚少
这些研究结果表明，在没有先验信息的情况下，MIDAS 可以识别以前未报道过的、低亲和力的、对功能有影响的 PMIs
实验结果4MIDAS 确定了已知和以前未知的相互作用MIDAS 发现了具有先前已知底物、产物和调节因子的 PMIs（图 3，I 至 N）
例如，葡萄糖-6-磷酸异构酶（GPI）与其底物葡萄糖-6-磷酸和果糖-6-磷酸（hexose-P）相互作用（图 3I）；磷酸果糖激酶（PFKP）与其产物果糖-1,6-二磷酸（F1,6BP/G1,6BP）和替代底物色酮糖-7-磷酸（Sedo-7P）相互作用（图 3J）；GAPD 酶与其底物果糖-6-磷酸（F1,6BP/G1,6BP）相互作用（图 3K）；PKM2 与 GDP 和多种氨基酸调节剂相互作用（图 3L）；PGAM1 和 PGAM2 与它们的底物 3-磷酸甘油酸（3PG）、2,3-二磷酸甘油酯（2,3-BPG）和磷酸烯醇丙酮酸（PEP）相互作用（图 3N）
MIDAS 还从不同的代谢途径中发现了许多以前未知的 PMI（图 3，I 至 N）
例如，酰基-CoA、肌醇磷酸酯、烟酰胺、腺嘌呤核苷酸和下游糖酵解中间产物与 GPI 相互作用（图 3I）；肌醇-1-磷酸酯与 GPI 相互作用（图 3F）；肌醇-1,4,5-三磷酸[Ins(1,4,5)P3]、2,3-BPG 和 3-羟基-3-甲基戊二酰基-CoA（HMG-CoA）与 GAPDH 相互作用（图 3K）；PKM2 与黄素、5-甲基四氢叶酸（5-MTHF）和甲状腺激素中间体 3,5-二碘-L-酪氨酸相互作用（图 3L）
已知 PKM2 在体外受甲状腺激素 T3 的异构调节
还检测到了葡萄糖激酶（GCK）、肝脏 6-磷酸果糖激酶（PFKL）、醛缩酶 B（ALDOB）、三糖磷酸异构酶 1（TPI1）、磷酸甘油酸激酶 1（PGK1）、磷酸丝氨酸氨基转移酶 1（PSAT1）和异柠檬酸脱氢酶 2（IDH2）等酶与途径间代谢物的相互作用
这些结果表明，MIDAS 可以检测整个代谢网络中蛋白质与代谢物之间的广泛相互作用
对多种代谢酶同工酶的 MIDAS 分析表明，它们之间既有共同的代谢物相互作用，也有不同的代谢物相互作用
果糖二磷酸酶催化 1,6-二磷酸果糖向 6-磷酸果糖的转化
两种同工酶（FBP1 和 FBP2）都与各种单磷酸核苷酸和 5-phospho-D-ribose 1-diphosphate（PRPP）相互作用，PRPP 是磷酸戊糖途径的最终产物，也是嘌呤和嘧啶代谢的底物（图 3M）
然而，只有 FBP1 与葡萄糖胺-6-磷酸发生了相互作用，葡萄糖胺-6-磷酸通常是六聚糖途径中的限速中间体，而六聚糖途径则来自果糖-6-磷酸
这些发现可能反映了 FBP1（葡萄糖生成组织）和 FBP2（非葡萄糖生成组织）之间的表达差异 (https://www.gtexportal.org/home/)
同样，磷酸甘油酸缄默酶的同工型（PGAM1 和 PGAM2）与大量代谢物相互作用，除了 Ins(1,4,5)P3 与 PGAM1 以及磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸 C-6 (PIP2) 和磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸 C-6 (PIP3) 与 PGAM2 外，它们之间几乎所有的代谢物都相同（图 3N）
这可能反映了不同的膜招募和/或磷脂酰肌醇激酶对磷酸甘油酸突变酶异构体的调控，而磷脂酰肌醇激酶是由生长因子信号激活的
异构体或同工酶之间的 PMI 差异可为其特定功能和调控提供信息
实验结果5LDHA 受三磷酸腺苷 (ATP) 抑制乳酸脱氢酶（LDH）催化丙酮酸还原为乳酸，同时将 NADH 氧化为 NAD
LDH 消耗丙酮酸（糖酵解的最终产物）与线粒体吸收丙酮酸并通过 TCA 循环氧化丙酮酸的过程相互竞争，以最大限度地产生 ATP
当线粒体丙酮酸氧化受到限制时，如缺氧或有氧糖酵解，就需要 LDH 来再生 NAD，使糖酵解通量得以继续
LDH 反应是可逆的，需要使用哺乳动物体内循环的主要碳水化合物乳酸作为支持细胞功能的燃料
因此，LDH 是碳水化合物代谢的一个关键节点
LDHA 和 LDHB 这两种主要同工酶具有不同的底物反应动力学和组织表达
对 LDHA 和 LDHB 的 MIDAS 分析显示了它们与几种代谢物的相互作用，其中大部分是这两种蛋白共有的（图 4A）
这些代谢物包括底物 NADH 和 NAD、结构相关的核苷酸、烟酰胺单核苷酸和黄素腺嘌呤二核苷酸、竞争性抑制剂草酰乙酸以及与 LDH 底物乳酸和丙酮酸相关的其他酮酸（图 4，A 和 B）
作者还观察到另外两类相互作用的代谢物，即腺苷核苷酸和游离及酰化 CoA
使用 DSF，作者发现 ATP 与 LDHA 和 LDHB 的相互作用 KD app = 0.636 mM 和 0.697 mM（图 4C），考虑到细胞内 ATP 的稳态浓度范围为 1 至 8 mM，这种亲和力较低且与生物相关
鉴于 KD app 值与细胞内 ADP 和 AMP 浓度[分别为 ~0.4 mM 和 ~0.04 mM]之间的差距，观察到的 LDH 异构体与二磷酸腺苷（ADP）和单磷酸腺苷（AMP）的相互作用可能与生理无关（图 4C）
两种 LDH 异构体的酶活性测定进一步证实了这一结论，因为 AMP 和 ADP 只有在超生理浓度下才能抑制 LDHA 和 LDHB（图 4D）
尽管与 LDHA 和 LDHB 的结合亲和力相似（图 4C），但 ATP 只抑制 LDHA 同工酶，其半最大抑制浓度（IC50）为 2.3 mM，而且这种抑制作用似乎与 NAD 和乳酸具有竞争性（图 4D）
这种异构体特异性抑制作用可能与 ATP 结合对两种蛋白热稳定性的相反影响有关（图 4C）
实验结果6在体外和细胞中，LDHA（而非 LDHB）会受到脂肪酰-CoAs 的抑制作者研究了 LDH 异构体与 CoA 或与短、中、长链脂肪酸（即酰基-CoAs）共轭的 CoA 之间的推定相互作用
长链（>12 个碳原子）脂肪酸酯化成 CoA 是它们在细胞内扩散和运输到线粒体基质的必要条件，在线粒体基质中，它们进行 β 氧化以产生 ATP
这些长链酰基-CoA 的积累是碳燃料过剩的信号
作者观察到，酰基-CoA 对 LDHA 的抑制作用与脂肪酸链长度有关
无论是单独的 CoA 还是脂肪酸链长度不超过 8 个碳的酰基-CoA 都不会影响酶的活性，C12:0-CoA（月桂酰-CoA）对 LDHA 的抑制作用 IC50 >100 μM（图 4E）
然而，C16:0-CoA（棕榈酰-CoA）、C18:1-CoA（油酰-CoA）和 C20:0-CoA（花生酰-CoA）等长链酰基-CoA 都能抑制 LDHA，其 IC50 值约为 1 μM（图 4E）
棕榈酰-CoA 对 LDHA 的抑制作用对 NAD 和乳酸都是非竞争性的，这表明棕榈酰-CoA 很可能在活性位点之外与 LDHA 结合
值得注意的是，与 LDHA 有 75% 氨基酸序列相同的 LDHB 对所有测试的酰基-CoAs 完全不敏感，即使浓度高达 100 μM（图 4F）
在观察到棕榈酰-CoA 可抑制 LDHA 但不能抑制 LDHB 后，作者使用了两种正交方法来检测是否存在物理相互作用
在 DSF 试验中，低微摩尔浓度的棕榈酰-CoA（与 IC50 相似）诱导形成了不同的 LDHA 热稳定性物种和 LDHB 热稳定性物种
LDHA 和 LDHB 还与固定在琼脂糖珠上的棕榈酰-CoA 结合，游离的棕榈酰-CoA 会破坏这两种蛋白的结合，但缓冲液或 C2:0-CoA（乙酰-CoA）不会
这些数据表明，LDHA 和 LDHB 直接与棕榈酰-CoA 以低微摩尔的亲和力相互作用
鉴于棕榈酰-CoA 在生理浓度下会抑制 LDHA，作者测试了这种抑制作用是否会在细胞中发生
作者使用 H9c2 大鼠心肌母细胞进行了代谢追踪实验，之所以选择这种细胞是因为它们原生表达两种同工酶，作者删除了 Ldha 基因、Ldhb 基因或两者
作者在有或没有牛血清白蛋白（BSA）结合棕榈酸的情况下用 13C 标记的葡萄糖处理细胞，这样可以将脂肪酸有效地输送到细胞中，并在细胞中酯化成棕榈酰-CoA（图 4G）
作者使用质谱法测量 13C 被乳酸吸收和同化的情况
所有四种细胞系[野生型（WT）、Ldha-/-、Ldhb-/-和 Ldha-/-Ldhb-/-]在与 BSA 结合物孵育后，细胞内棕榈酸酯的含量都有类似（约 80%）的增加
在 WT 和 Ldhb-/- 细胞中，棕榈酸酯降低了 13C 葡萄糖的乳酸标记，但在缺乏 LDHA 的细胞中却没有降低（图 4H），这表明棕榈酸酯对葡萄糖-乳酸转化的抑制在这些细胞中依赖于 LDHA
碳水化合物代谢中的多种酶对酰基-CoA 的丰度很敏感，因此为了更具体地研究 LDH 将乳酸转化为丙酮酸的情况，我们进行了实验，跟踪 13C 乳酸向 13C 丙酮酸的转化（图 4I）
同样，棕榈酸酯的处理减弱了 WT 和 Ldhb-/- 细胞中 m+3 丙酮酸的生成，但 Ldha-/- 或 Ldha-/-Ldhb-/- 细胞中的丙酮酸标记不受影响（图 4J）
为了测试脂肪酸代谢的上游或下游中间产物抑制 LDHA 的可能性，作者在三醋嗪 C（酰基-CoA 合酶的抑制剂，可催化脂肪酸与 CoA 的共轭）存在的情况下进行了 13C 葡萄糖和 13C 乳酸盐追踪实验
在这两项实验中，三尖杉酯酶 C 阻止了棕榈酸酯介导的对乳酸和丙酮酸标记的抑制，从而证明棕榈酸酯抑制 LDHA 活性需要与 CoA 结合
为了确定抑制 LDHA 是否需要酰基-CoAs 的分解，我们使用 2,2-二甲基棕榈酸酯（DiMePal）或 2,2-二甲基硬脂酸酯（DiMeSte）进行了实验
DiMePal 和 DiMeSte 是二甲基化脂肪酸类似物，可通过酰基-CoA 合成酶与 CoA 结合，但不能通过 β 氧化进一步代谢
与棕榈酰-CoA 相似，DiMePal-CoA 在体外抑制 LDHA，但不抑制 LDHB
DiMePal 或 DiMeSte 可抑制 13C 葡萄糖或 13C 乳酸盐的示踪
这些结果表明，棕榈酸酯对 LDHA 的抑制作用是由长链酰基-CoAs 而非上游或下游脂肪酸中间体介导的
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