编辑：医学喵记事文字：医学喵记事HapAmp是一种利用单倍体不足作为进化力的方法，用于驱动体内基因扩增，以增加基因表达水平，以解决微生物细胞工厂中代谢途径瓶颈的问题
该方法能够高效、可滴定且稳定地将多达47个异源基因拷贝整合到酵母基因组中
通过HapAmp，在代谢工程中成功提高了倍半萜橙花叔醇、单萜柠檬烯和四萜番茄红素的产量
在一个工程步骤中，柠檬烯的产量提高了20倍，达到了在烧瓶培养中达到1 g/L
同时，异源蛋白质在酵母中的产量也显著增加
一、实验目的为了解决微生物细胞工厂中基因表达水平不足的问题，常需要增加引入基因的表达量，这通常通过操纵转录控制元件来实现，但受到个体构建的阈值限制
一种解决方法是通过基因扩增来提高表达水平，而HapAmp是一种利用单倍体不足作为进化力量的方法，可稳定地整合多个异源基因拷贝到酵母基因组中
这种方法在代谢工程中具有广泛应用，可显著提高产品产量，例如倍半萜橙花叔醇、单萜柠檬烯和四萜番茄红素
酵母酿酒酵母常用于此技术，通过引入多拷贝酵母附加型质粒或基因组整合到核糖体DNA位点，以增加基因剂量
HapAmp可以通过自动选择标记来实现稳定性，无需选择性抗生素或营养缺陷型系统
在单倍体不足状态下，可以通过调整启动子强度或翻译效率来扩增基因，这种方法在代谢工程中有潜在应用，通过代谢工程可以提高萜烯类产物的生产以及药用蛋白质的高产表达
二、实验结果2.1体内基因扩增的构建设计基因扩增需要细胞适应性相关基因、支持重组的同源DNA序列和强复制起点，在酵母基因组的rDNA区域和CUP1区域中存在这三个元件的串联重复
第1臂同源于单倍剂量不足基因的启动子区域，第2臂同源于开放阅读框的起始部分，允许通过同源重组将构建体插入基因组
第1臂的下游有选择性标记和同源的第3臂，后者与单倍体不足基因的终止子区域同源
在Arm 3和Arm 2之间，有一个自主复制序列 (ARS) 和一个较弱的启动子
如果要异源表达感兴趣的基因，通过较弱的启动子进行表达将降低单倍体不足基因每个拷贝的蛋白质产量，从而减慢酵母的生长速度
随着酵母朝着更快的生长方向进化，同源臂3之间的区域将发生天然扩增
因此我们找了两种构体，来进行基因驱动
2.2使用RPL25或SEC23单倍体不足的基因位点驱动扩增基因扩增涉及三个要素：与细胞适应性相关的基因、支持重组的同源DNA序列和强复制起点
们在酵母中采用了核糖体60S亚基蛋白L25 (RPL25) 和COPII囊泡外壳的Sec23p-Sec24p异二聚体的SEC23编码组件
通过设计四种构建体，其中包括RPL25作为驱动基因、LEU2作为选择标记，并使用早期激发的ARS306以促进扩增；以及以SEC23为驱动基因、潮霉素B抗性基因hphMX的三个构建体作为选择标记，并使用强ARS1max促进扩增
我们选择了适合的启动子，包括YEF3、ERG1、PDA1、BTS1、GLO2和COG7，以控制目标基因座
在定量表征中，发现与天然启动子相似或更强的启动子强度下，yEGFP基因被整合到基因组的单个拷贝中，且荧光水平相似
当用较弱的启动子替代天然启动子时，yEGFP基因拷贝数和荧光增加，呈现很强的正相关性
我们进一步减弱了翻译过程，以增加SEC23基因座的拷贝数
增加的拷贝数对大多数菌株的生长速率没有负面影响，除了特定克隆，其整合拷贝数异常高
本研究提供了一种在酵母中实现基因扩增的方法，调整启动子强度和其他遗传元素，成功地增加了目标基因的拷贝数和表达水平，从而为工业生产和代谢工程领域提供了新的可能性
2.3提高单萜柠檬烯的异源生产利用Erg20p N127W突变体，该突变体通过排除C15链从而生成GPP池，并结合蛋白质降解标签以降解内源的C15合酶Erg20p，以减少Erg20p的C10节点，将GPP转向单萜生产
在甲羟戊酸途径增强的菌株中，这种方法递送的剂量低于100 mg/l−1单萜，比之前的倍半萜工程低一个数量级
我们采用生长素诱导的蛋白质降解机制，利用具有内源Erg20p的甲羟戊酸途径增强的背景菌株，以减少通过天然甾醇途径的竞争通量
扩增区域包括多个基因的融合体：Y-FAST-2A、来自大肠杆菌的麦芽糖结合蛋白，用于提高溶解度，一个短接头，来自柑橘柠檬的柠檬烯合酶，一个甘油接头和突变体作为GPP合酶
将这两个构建体转化到背景菌株的RPL25基因座中，产生菌株LIM141M（P PDA1）和LIM141MH（P BTS1）我们对四个生物重复（LIM141R代表三个生物重复，LIM141R2代表一个生物重复）进行了表征
在LIM141R中，每个基因组约有2个柠檬烯合酶/Y-FAST模块的拷贝
LIM141R产生约40 mg l-1柠檬烯，与之前的菌株LIM141和无基因融合的Erg20p N127W相同
然而，在LIM141R2中，柠檬烯的产量为~300 mg l-1，伴随更快的生长和更高的Y-FAST荧光水平
LIM141R2的改进可能与意外的遗传变异有关
使用HapAmp柠檬烯合成模块，菌株LIM141M和LIM141MH产生了比LIM141R和之前使用质粒的努力更多的柠檬烯
其中，菌株LIM141M在96小时时产量最高，约为0.95 g l-1柠檬烯
该产量比之前在酵母中获得的最高产量高出5.6倍，比在大肠杆菌中分批培养中获得的最佳产量高出约2倍
与LIM141M相比，LIM141MH表现出较慢的生长和较低水平的Y-FAST荧光，尽管具有更多的柠檬烯合酶/Y-FAST模块的拷贝
两种菌株还积累了约12 mg l-1的单萜醇香叶醇，这通常由具有增加GPP库的酵母产生
这些菌株没有积累C15醇或C20醇，表明FPP和C20香叶基香叶基焦磷酸（GGPP）的亚细胞库较低，并且柠檬烯合成模块的扩增导致了用于单萜生产的碳通量增加
这些结果表明，通过HapAmp技术实现的基因扩增在单萜的生产中取得了显著的成功，为更高效的生物工业生产提供了有力支持
三、实验方法3.1酵母培养有一个方法可以从甘油储备液中取得的酵母细胞划线于含有6.9 g l -1酵母氮碱（YNB）、20 g l -1葡萄糖和20 g l -1琼脂的琼脂培养基上，pH值调节至6.0
在MES缓冲的YNB-葡萄糖培养基中，通过将种子培养物接种到培养基中，以产生培养物，然后在350 rpm 30°C培养箱中培养
另一种方法是在十二烷覆盖的两相烧瓶中进行培养，其中细胞经过预培养后转移到含有20 g l -1葡萄糖的MES缓冲YNB培养基中，然后加入十二烷
用于橙花叔醇/柠檬烯生产菌株的表征采用了十二烷覆盖的两相烧瓶培养方法
在此研究中，从甘油储备液中取得的酵母细胞划线于含有200 g l -1葡萄糖和20 g l -1琼脂的高葡萄糖YNB琼脂培养基上，然后在MES缓冲的YNB-20 g l -1葡萄糖培养基中预培养细胞
然后将细胞收集并重悬于新鲜的发酵培养基中，接种到含有十二烷的培养基中，通过在烧瓶中培养来进行生产
对于番茄红素生产菌株和表达色蛋白/HPV16 L1的菌株，也采用了类似的培养方法，将预培养的酵母细胞接种到新鲜的培养基中，然后在适当的条件下进行培养
3.2蛋白质纯化酵母细胞匀浆步骤如下：将酵母细胞加入磷酸盐缓冲盐水缓冲液中，添加 2 mM 乙二胺四乙酸，涡旋搅拌玻璃珠 15 分钟
使用 Mini-PROTEAN® 预制凝胶上的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，检查全细胞裂解物、裂解物上清液和裂解物沉淀
随后，将可溶性分层样品加载到薄壁超透明管中，梯度由 1 ml 20% 碘克沙醇/PBS 缓冲液、1 ml 30% 碘克沙醇/PBS 和 1 ml 40% 碘克沙醇/PBS 组成
使用 SW41 Ti 转子或 Beckman Optima L-100XP 超速离心机以 150,000 × g 超速离心 2 小时 30 分钟
使用 Bradford 法测量蛋白质浓度，利用透射电子显微镜进一步检查样品，并在 Mini-PROTEAN® 预制凝胶上确认纯度
3.3流式细胞术使用 BD Accuri™ C6 流式细胞仪进行单细胞荧光分析
对于表达 yEGFP 的细胞，取样并直接进行 yEGFP 荧光表征
对于表达 Y-FAST 的细胞，在分析前取样，并与 20 μM HMBR 溶液混合
使用 488 nm 激光激发 GFP 和 Y-FAST 荧光，使用带通滤波器 (530/20) 监测荧光信号 (FL1.A)
每个样本记录了 10,000 个事件
使用 BD Csampler 软件提取 FSC.A、SSC.A 和 FL1.A 的平均值
GFP 和 Y-FAST 的荧光水平表示为在菌株 GH4 3 的指数生长期细胞中背景荧光的倍数
四、结语本研究成功开发了一个用于酿酒酵母中高水平表达的体内基因扩增系统，为生物工程和工业应用领域提供了有力的工具和方法
通过精心设计和优化，我们实现了在酿酒酵母细胞中对目标基因的高效扩增，为蛋白质生产、代谢工程和其他相关研究提供了新的可能性
此外，我们还将进一步研究扩增系统在不同条件下的适应性，以确保其在不同应用场景下的可靠性和可重复性