文|郑法途说编辑|郑法途说引言小核糖核酸病毒科包括一组非常多样化的病毒，其正义单链RNA基因组长度从6.7到10.1 kb不等，具有非包膜二十面体衣壳
该科包括一大群人类和动物病原体，其中人类病原体的病毒包括脊髓灰质炎病毒、甲型肝炎病毒和口蹄疫病毒
截至2021年，国际病毒分类委员会（ICTV）已批准68属158种
除犬picodicistrovirus和刺猬dicipivirus外，小核糖核酸病毒(pv) RNA具有一个长开放阅读框(ORF)，编码为多蛋白，该多蛋白经病毒编码的蛋白酶共同和翻译后，加工产生衣壳蛋白1A、1B、1C和1D，通常也称为VP4、VP2、VP3和VP1 (P1区)，以及非结构蛋白2A、2B、2Chel (P2)和3A、3B (VPg)、3Cpro、3Dpol (P3)
基因组的3 '端是聚腺苷化的，而5 '端与一个小的病毒蛋白VPg共价连接
在过去的十年中，广泛的逆转录聚合酶链反应(rt - pcr)和序列无关的元基因组研究的广泛应用已经导致鉴定出以前未知的感染绵羊和山羊的肠道pv，揭示了小型家养反刍动物肠道病毒的多样性
最近，在匈牙利农场收集的无症状绵羊(36.2%，17/47)和山羊(25.8%，16/62)的粪便标本中发现了暂称为卵状病毒和gopivirus的新型pv
在全基因组序列分析中，新型PV与牛株PV TCH6/2013/USA 的遗传亲缘性最高，后者是匈牙利研究之前已知的唯一一种Bopivirus A
严格按照ICTV对小核糖核酸病毒科物种划分的分类标准，绵羊和山羊博皮病毒已被初步归类为博皮病毒B
有趣的是，通过元基因组方法和随后使用特异性RT-PCR筛选，最近还在澳大利亚黇鹿和马鹿的粪便中发现了具有遗传差异的Bopivirus，可能是另一种Bopivirus C的成员，这表明Bopivirus存在于野生和家养反刍动物中
在本研究中，为了更好地了解这些新型pv的生态学并进一步研究其宿主物种谱，我们将bopivirus的研究扩展到四种高山野生反刍动物以及我们实验室提供的绵羊和山羊的粪便样本中
随后，我们分别在一只高山山羊和一只绵羊中检测到的两种病毒株的近全长基因组的生成，增加了关于这些病毒的遗传特征的数据
2 材料和方法采样在检测有蹄类动物肠道病毒的被动监测计划框架内，国家野生动物疾病参考中心于2017年9月至2019年12月在意大利西北部收集了508只野生和家养反刍动物的存档肠道样本(粪便和直肠样本)，并对其进行了bopivirus分子筛选
之后，收集了61只马鹿、77只狍子和43只岩羚羊在常规狩猎季节采集的粪便样本，以及在Valle d’aosta进行物种控制活动时收集的32只高山野山羊的粪便样本
此外，在Piemonte约29.8平方公里和Valle d’aosta约14.9平方公里范围内的5个绵羊场和16个山羊场分别采集的临床健康绵羊和山羊的肠道标本也被纳入筛查
所有取样动物年龄均大于12月龄，在牧场自由放牧
bopiviruses的分子筛查按照制造商的说明，使用 TRIzol LS从每个粪便标本中单独提取总 RNA
使用引物HBG-3D-Screen-F和HBG-3D-Screen-R对Bopivirus RNA的存在进行RT-PCR评估，该引物旨在扩增Bopivirus属的所有成员，并靶向3DRdRp编码区的627-nt片段(表1)
RT 和 PCR 是一步完成的，使用 SuperScript III 一步法系统，并遵循前面描述的热条件
扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分析，并在溴化乙啶染色后通过UV观察
利用NCBI Genbank上的bopi病毒全基因组序列比对，设计了新的引物和探针，用于定位5 ' UTR的162 nt片段
设计的引物和探针用于实时RT-PCR (qRT-PCR)，定量检测所有定性RT-PCR阳性样本的病毒载量(表1)
采用SuperScript III platinum OneStep定量RT-PCR系统进行病毒RNA定量，体积为25 μL，其中包括5 μL提取的RNA和20 μL主混合物
引物和TaqMan探针的浓度分别为200 nM和100 nM
每次运行使用含有合成的Ovine/TB14/2010-HUN (MW298057) 162 nt片段的质粒标准TOPO XL PCR (Invitrogen Ltd)的10倍连续稀释
qRT-PCR检测可检测到临床样品中提取的>101个RNA拷贝/5 μL标准RNA和1.9 × 101个RNA拷贝/5 μL模板RNA(图S1A和S1B)
采取标准预防措施，以避免定量和定性RT-PCR程序的污染
质粒在单独的房间制备，含有质粒标准品的微管不带入RT-PCR设置室
除了工作空间的空间分离外，每次运行都包括RNA提取、qRT-PCR或RT-PCR和巢式PCR的阴性对照
表 1. 本研究使用的引物列表
核苷酸位置参照以下序列:aBopivirus A分离物TCH6 (GenBank登录号:KM589358);山羊乙型肝炎病毒株/AGK16/2020-HUN (GenBank加入号:MW298058)基因组测序和系统发育分析所有扩增子均使用QIAquick凝胶提取试剂盒纯化，并使用BigDye Terminator Cycle chemistry和3730 DNA分析仪进行直接测序
基本局部比对搜索工具和FASTA使用默认值来查找同源命中
采用改良的3′快速扩增cDNA末端(RACE)技术和Oxford Nanopore Technologies (ONT)测序技术，分别采集了高山山羊和绵羊的粪便样本，每5 μL模板的病毒载量>104个拷贝，构建了接近完整的基因组
简单地说，通过Super-Script IV逆转录酶(Invitrogen Ltd)使用引物QT将dna处理过的RNA逆转录为单链cDNA
然后使用LaTakara PCR试剂盒2.1版进行PCR，正引物BoPI-5'UTR /For和反向引物QO (表1)，应用以下热谱图:在94°C活化2分钟，然后进行40次循环扩增(94°C 30秒，48°C 30秒，68°C 8分钟)，最后在68°C延长8分钟
PCR产物用AMPure XP珠(Beckman Coulter, USA)清洗，并使用dsDNA HS Assay Kit 的Qubit 4.0仪器进行定量
采用上述qPCR方法检测病毒扩增子浓度
根据结扎测序试剂盒的制造商说明，独立制备两个纳米孔测序文库
简单地说，使用NEBNext End Repair/dA tailtail模块对DNA末端进行末端修复和dA尾化，并连接到测序适配器上
每个文库在Oxford Nanopore MinION Flongle流动池(R9.4.1)上加载75 μL测序混合液，运行15 h，使用MinKNOW软件包提供的GUPPY (v3.1.5)将MinION测序设备生成的原始FAST5文件转换为FASTQ
使用Genome Detective Virus Tool Premium 进行序列修剪、过滤和病毒序列组装
将得到的一致序列草案进行BLASTn搜索
序列比对使用genous Prime version 2.4.1的MAFFT多重比对程序version 7.388插件进行
在MEGA X软件中，使用邻居连接法进行系统发育分析，该方法通过启动1000个重复提供统计支持
序列提交本研究生成的核苷酸序列存储在GenBank中，登录号为ON497046-7 和ON497048-65
结果和讨论在213只野生反刍动物中，有5只动物检测到bopivirus RNA，总流行率为2.3%(5/213)，包括2只马鹿(3.3%，2/61)、1只狍子(1.3%，1/77)、1只岩羚羊(2.3%，1/43)和1只高山山羊(3.3%，1/32)
病毒载量范围为1.9×101 ~ 1.9×104 RNA拷贝/5μL RNA模板，其中高山野山羊粪便样品的滴度最高
在家产小型反刍动物标本中，绵羊的阳性率为10.9%(14/128)，而所有山羊样本均为阴性(0/167)(表2)
分析各农场的阳性分布，在所有测试的绵羊群中均发现RNA bopi病毒，在皮埃蒙特评估的两个羊群中检测率为14.7%(11/75)和2.4%(1/41)，在Valle d'Aosta调查的三个农场中检测率为16.7%(1/6)
利用引物对HBG-3D-Screen-F和HBG-3D-Screen-R获得的扩增子对19份阳性样本进行部分3DRdRp序列测定
通过FASTA和BLAST分析，所有序列之间的nt同一性为67% - 100%，而与数据库中现有的bopi病毒的nt同一性为66.0 - 98.5%
在基于3DRdRp的树(图1a)上，从羚羊、狍子、高山野山羊和绵羊粪便样本中生成的序列与先前在匈牙利农场的山羊和绵羊中检测到的bopi病毒聚在一起
该群体的nt同一性为96.8-100%
在马鹿粪便标本中检测到的另外两种bopivirus PECER16/2018/ITA和PECER21/2018/ITA彼此的同源性为99.3%，但与本研究中发现的其他bopivirus序列有远亲关系，与澳大利亚休休鹿和马鹿中发现的bopivirus序列的同源性最接近(90.8-91.2%)(图1a)
利用ONT测序平台对Bopivirus/Alpine-ibex株/12/2018/ITA和Bopivirus/Sheep/14-73/2018/ITA株
从高山野山羊样本中提取的1101825个病毒序列(平均长度为1437个碱基)被映射并组装到牛PV TCH6/2013/US菌株上，得到全长7203-nt的独特序列，覆盖深度为349778，而从绵羊样本中提取的57183个病毒序列被映射到6949-nt的独特序列
Alpine-ibex/12/2018/ITA和Sheep/14-73/2018/ITA的基因组编码序列长度为6609 nt，单个ORF编码的预测多蛋白为2202aa
该多蛋白的基因组布局与Bopivirus属其他成员相似，包括4个结构蛋白(VP4、VP2、VP3和VP1)和7个非结构蛋白(2A-2C和3A-3D)
通过序列比对和NCBI保守域搜索预测的裂解位点分别为L/A (VP4/VP2)、E/G (VP2/VP3、VP3/VP1)、E/D (VP1/2A、2B/2C、2C/3A、3B/3C)、G/P (2A/2B)、Q/G (3A/3B)和E/V (3C/3D)
在完整的多蛋白中，山羊-ibex/12/2018/ITA和绵羊/14-73/2018/ITA之间的整体aa一致性为94.6% (91.1% nt)，而与其他牛流感病毒的aa一致性为58.7% (56.8% nt)至98.0% (94.5% nt)(表3)
在系统发育分析(图1)中，两种意大利牛流感病毒与匈牙利山羊/AGK16/2020-HUN (MW298058)和绵羊/TB14/2010-HUN (MW298057)分离
2021)和数据库中现有的另外两个序列(MZ67928-Sheep/65-k141/231889/2022/CHN和on044229 - capine /SWUN/B1/2022/CHN)(未发表的数据)，进入新的拟议物种Bopivirus B (90.0-94.6% nt和94.6-98.0% aa鉴定)(图1b)
高山山羊/12/2018/ITA和绵羊/14-73/2018/ITA的完整编码序列与绵羊/TB14/2010-HUN (MW298057)、山羊/AGK16/2020-HUN (MW298058)、牛/TV-9682/2019-HUN (MW298059) (László et al.， 2021)、鹿/VIC82-2020/AUS (MZ436972) (Huaman et al.， 2021)和牛/A分离物TCH6/US (KM589358)的完整编码序列一致
在本分析中，两个意大利菌株在P2 (93.9% nt和96.7% aa)或P3 (95.2% nt和98.8% aa)中均表现出高核苷酸保守性，而P1的同源性为85.0% nt (91.9% aa)，在VP1蛋白编码区域(75.6% nt和82.0% aa)中存在显著差异
在基于vp1的树(图1c)中，意大利毒株分为两个不同的亚群，可能代表了所提出的Bopivirus B种中的两种不同的基因型(B1和B2)
结果表明，高山山羊/12/2018/ITA为B2型vp1 (95.5% nt和98.3% aa)，绵羊/14-73/2018/ITA为B1型vp1 (78.8% nt和84.6% aa)
表 2. 在意大利西北部采集的高山山羊、羚羊、狍子、马鹿和绵羊粪便样本中波比病毒的分子检测表 3. bopivirus/Alpine-ibex/12/2018/ITA 和bopivirus/sheep/14-73/2018/ITA 全基因组编码序列与GenBank中现有全序列的aa和nt %鉴定比较结论本研究在意大利西北部阿尔卑斯山脉地区广泛养殖的牲畜与野生动物之间的生态相互作用可能为病原体的传播提供理想的条件，通过筛选野生和小型家养反刍动物的档案粪便标本，检测到博皮病毒RNA，总流行率为3.7%(19/508)
在本次调查之前，已知的牛、绵羊、山羊、马鹿和黇鹿是博匹病毒的宿主
本研究在所有野生物种中均检测到病毒RNA，包括狍(1/77)、岩羚羊(1/43)和高山野山羊(1/32)，这些野生物种对bopivirus感染的易感性迄今未见报道
我们的研究结果还表明，这些新型pv在意大利的羊群中传播，尽管总体检出率(10.9%，14/128)低于匈牙利调查羊的检出率(36.2%，17/47)
相反，在167个山羊粪便样本中，没有一个检测出bopivirus RNA呈阳性，即使所调查的山羊和羊群彼此接近，而且所有样本动物都在牧场上自由放牧
在匈牙利的调查中，在绵羊和山羊中都观察到与年龄相关的流行模式，小于12个月的动物的阳性率高于成人，这表明对感染的易感性存在年龄限制模式
在我们的研究中，所有测试的绵羊和山羊都大于1岁
因此，可以假设博皮病毒在成年动物中起次要的流行病学作用
在绵羊粪便样本中发现的低病毒载量也证实了这一发现
基于部分3DRdRp基因，在绵羊、狍、羚羊和高山山羊中检测到的博皮病毒相互密切相关，并与最近在匈牙利农场的绵羊和山羊粪便样本中发现的新型博皮病毒密切相关，这暗示本研究调查的反刍动物物种中这些病毒的宿主物种限制有限
由于波皮病毒是一种新发现的病毒，有关其多样性的信息仍然有限，因此应依靠对全基因组的序列分析来确定其特征
本研究将改进的3 ' RACE协议与ONT平台相结合，分别在阿尔卑斯野山羊(ON497046)和绵羊(ON497047)粪便样本中检测到的两个菌株的几乎完整的基因组进行了重建
在完整的基因组树中，这两个意大利病毒株与匈牙利的羊和山羊病毒株形成了一个单系集群，与目前归类为Bopivirus a的牛Bopivirus (57.3-57.7% nt同源性)和仍未分配的鹿Bopivirus VIC82-2020/AUS 截然不同，后者可能是另一个新种的成员，被提出为Bopivirus C
本研究中检测到的高山野山羊和绵羊病毒与匈牙利的Goat/AGK16/2020-HUN和Ovine/TB14/2010-HUN毒株相似，这支持了它们在候选种Bopivirus b中的分类
对VP1编码基因的序列分析表明，匈牙利农场检测到的绵羊和山羊毒株形成了两种不同的VP1型或基因型(基因型B1和B2)，都包括绵羊和山羊的Bopivirus
结果表明，绵羊/14-73/2018/ITA为B1基因型，阿尔卑斯-ibex/12/2018/ITA为B2基因型，两种基因型在调查区域可能存在共循环
在本次调查中，马鹿种群中也观察到活跃的病毒循环，表明这种野生物种的bopivirus感染并不罕见，也不局限于某些环境
在对部分3DRdRp基因的分子分析中，两个马鹿序列PECER16/2018/ITA和PECER21/2018/ITA与澳大利亚休牧和马鹿中检测到的病毒紧密分组，初步归类为新提出的物种Bopivirus C，从而进一步扩大了本调查中检测到的Bopivirus株的遗传多样性
总的来说，本研究的结果虽然明确表明博皮病毒是反刍动物病毒群的常见组成部分，但也提出了一些问题，特别是关于它们的致病潜力和野生动物在这些病毒在家畜中的流行病学中的作用
在我们的分析中，所调查的动物种群在采样时显然是健康的
因此，需要进一步的研究来解决bopivirus对反刍动物健康可能产生的临床影响
总之，我们证明了意大利家养和野生反刍动物中存在遗传多样性的波比病毒，这证实了先前在匈牙利和澳大利亚进行的调查结果
为了阐明这些发现的相关性，并确定这些新型pv在野生和家养反刍动物中的流行病学和临床重要性，需要进行进一步的研究