干货 | 靠谱 | 实用 解读：2019-nCoV是一种新型冠状病毒，虽然也属于β冠状病毒属，但它与SARS-CoV有较大的差异，因此被认为是一种能感染人类的新型冠状病毒。
尽管我们的系统发育分析结果表明蝙蝠可能是这种病毒的原始宿主，但武汉海鲜市场上出售的动物很可能是促使该病毒在人体内出现的中间宿主。
2019年12月下旬，中国武汉报道了由于一种未知的微生物而导致病毒性肺炎的患者。
随后鉴定出一种新的冠状病毒为致病性病原体，临时命名为2019新型冠状病毒（2019-nCoV）。
截至2020年1月30日，已确认9000例以上的2019-nCoV感染病例，其中大部分生活在或曾前往武汉，已确认人与人之间的传播。
由中国国家重点研究发展计划，中国传染病控制与预防重大专项，中国科学院，山东第一医科大学资助，对来自9例住院患者的支气管肺泡灌洗液和培养分离物的样品进行了高通量测序（NGS），其中8例曾去过武汉的华南海鲜市场。
从这些个体获得了完整的和部分的2019-nCoV基因组序列。
使用Sanger测序连接病毒重叠群以获得全长基因组，其末端区域通过快速扩增cDNA末端来确定。
这些2019-nCoV基因组和其他冠状病毒基因组的进化树分析用于确定病毒的进化史并帮助推断其可能的起源。
进行同源性建模以探索病毒的可能受体

结合特性。
其中，国家CDC的基因测序策略如下：通过Sanger，Illumina和Oxford纳米孔组合测序，从六个样品（WH19001，WH19005，WH19002，WH19004，WH19008以及YS8011）中获得了2019-nCoV的全基因组序列。
首先，使用QIAamp Viral RNA Mini Kit直接从临床样品中提取病毒RNA，然后使用SuperScript III逆转录酶（ThermoFisher, Waltham, MA, USA）和N6随机引物合成cDNA，然后用DNA聚合酶I，Large (Klenow) Fragment（ThermoFisher）进行第二链合成。
病毒cDNA文库制备使用Nextera XT Library Prep Kit （Illumina, San Diego, CA, USA），之后使用Agencourt AMPure XP （Bechman Coulter, Brea, CA, USA）磁珠纯化， 之后使用Invitrogen Qubit 2.0 Fluorometer 定量。
制备好的DNA文库，在MiSeq或iSeq （Illumina）平台上进行测序，使用300-cycle的核心测序试剂盒。
每个样本获得的数据量为1.2~5GB。
使用先前描述的标准(J Infect 2016; 72: 52-59)过滤每个病毒样本的原始fastQ文件，然后使用CLCBio软件版本11.0.1重新组装。
还使用蝙蝠衍生的SARS样冠状病毒分离株bat-SL-CoVZC45（登记号MG772933.1）作为参照完成拼装。
使用CLCBio软件进行variant calling，基因组比对和序列插图，并通过Sanger测序确认组装的基因组序列。
根据制造商的说明，使用Invitrogen 5'RACE系统和3'RACE系统（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA），对cDNA末端（RACE）进行了快速扩增以获得5'和3'末端的序列。
设计用于5'和3'RACE PCR扩增的基因特异性引物，以从两个区域获得大约400-500 bp的片段。
根据制造商的说明，将纯化的PCR产物克隆到pMD18-T Simple Vector（TaKaRa，Takara Biotechnology，中国大连）和具有化学感受态的大肠杆菌（DH5α细胞；TaKaRa）中。
使用M13正向和反向引物对PCR产物进行测序。
从9位患者获得的10条2019-nCoV基因组序列极为相似，显示出超过99.98％的序列一致性。
值得注意的是，2019-nCoV与2018年在中国东部舟山采集的两种蝙蝠衍生的严重急性呼吸综合征（SARS）样冠状病毒bat-SL-CoVZC45和bat-SL-CoVZXC21密切相关（一致性为88％），但与SARS- CoV（约79％）和MERS-CoV（约50％）距离较远。
进化树分析表明，2019-nCoV属于Betacoronavirus属Sarbecovirus亚型，其最接近的亲属bat-SL-CoVZC45和bat-SL-CoVZXC21的分支长度相对较长，并且在遗传学上与SARS-Cov不同。
同源性建模显示，2019-nCoV具有与SARS-CoV类似的受体结合域结构，尽管某些关键残基处存在氨基酸差异。
2019-nCoV与SARS-CoV的差异很大，可以被认为是一种新型的人类感染性β冠状病毒。
尽管我们的进化树分析表明，蝙蝠可能是这种病毒的原始宿主，但武汉海鲜市场上出售的动物可能是促进人类紧急感染该病毒的中间宿主。
重要的是，结构分析表明2019-nCoV也许能利用ACE2受体，虽然其结合效能仍有待测试。
毫无疑问，该病毒的未来进化，适应和传播仍旧需要紧急调查。
来源：https://www.thelancet.com/journals/lancet/article/PIIS0140-6736(20)30251-8/fulltext