葡萄是葡萄科葡萄属多年生落叶藤本植物，在我国果树生产中占有至关重要的地位，我国葡萄种植面积和产量多年来保持着持续增长,但在葡萄生产中经常遇到干旱、低温和盐碱等逆境胁迫导致产量损失巨大，由前人研究结果可知，UBP在多种植物响应的非生物胁迫响应中起到关键作用,但目前对于葡萄 UBP的研究报道相对较少
我们将采用生物信息学分析的方法，下载葡萄基因组序列及蛋白序列,对葡萄中 UBP基因家族进行鉴定,从基因结构及系统进化分析、染色体定位及共线性分析等方法进行全面分析，同时结合实时荧光定量 PCR技术分析在不同非生物胁迫处理下的表达模式，研究明白UBP基因家族在葡萄抵抗逆境胁迫中发挥的作用
UBP基因的分析当葡萄植株长至5-6叶时,选择 100株长势良好且生长状况一致的藓红葡萄幼苗分别用200 umol·L-水杨酸、200 mol·L茉莉酸甲醋和蒸留水喷酒植株,每个处理5株.3次重复,以蒸留水作为对照;在处理后 5 min,2、4.6和8h,每个处理随机选取3株,每株随机采集3-5 片功能叶,采集后立即置于液氮冷冻后于-80C条件下保存.备用于提取总RNA
在农场试验基地采集郭红葡萄成熟期的卷须、叶、茎、花、根、种子、葡萄果肉和果皮8个组织,所有组织均采集于同一单株,每个组织3 次生物学重复
随即将样品用液氮冷冻并在-80C条件下保存.备用于提取总 RNA
在拟南芥中检索到27个UBP基因序列号,然后在NCBI中分别搜索上述基因，下载对应基因的编码序列、蛋白序列，以获得的编码序列为查询序列，在葡萄数据库中进行 BLAST 搜索，去除结构不完整的序列，在DNAMAN8工具中进行筛选，剔除重复片段序列，以该片段序列在葡萄数据库中获取相应序列的基因及蛋白序列
使用MECA7和邻近法对 VVUBPOsUBP和 AtUBP 蛋白序列进行多序列比对，并构建系统发育树，使用GSDS获得WUBP 基因结构图，MEME 软件进行 WUBP蛋白 motif序列分析
WUIBP 基因在梁色体上的物理分布和位置用MapChart绘制，使用对重复基因的编码序列进行比对，并使用KaKscalculator脚本基于比对结果计算非同义替换率的值
使用公式:T=Ks/2R,估算复制事件的大致日期,其中R代表核基因的变异率
假设R为1.5x10-双子叶植物中每个基因每年8个同义替换
UBP基因对葡萄的影响在葡萄基因组中共鉴定出 27个 UBP基因,CDS列长度、编码氨基酸长度、理论等电点、分子量大小和亚细胞定位预测结果如图所示，WUBP基因编码蛋白的氨基酸数量为 197~1 603 个预测的分子量范围为22 879.6-180 491.6kDa.理论pl为5.38~10.24.大部分的BUP为酸性蛋白，亚细胞定位预测分析结果表明,有 10个 VVUBP定位在在细胞外基质中,9个定位在细胞核中,5个定位在质膜上,其余定位在线粒体、细胞质和内质网
为了进一步了解葡萄 UBP家族成员进化关系,对其进行了分类，用27个拟南芥UBP、27个水稻UBP和27个葡萄 UBP 的蛋白序列构建了系统发育树，根据UBP蛋白的同源性和系统发育树,把81个UBPS分为8组
为了更好地分析 VvUBP家族成员,将葡萄 UBP单独构建进化树，并采用MEME对其进行 motif分析和基因结构分析
结果如图2所示，WeUBP可以分成3个类别,分别是Class IClassI和 ClassI
通过对VUBP的基因结构分析,发现 MUBP内含子相差较大，但基本都含有 1-2个外显子
27个 WUBP基因被分配在不同染色体上,其中4号、19号和未知染色体上具有数目较多的 VeUBP基因
在葡萄20条染色体上共展现了 23个VUBP基因，其余4个无法明确染色体具体位置，葡萄的4号和19梁色体上出现的 WUBP基因最多,有3-4个，其余染色体上被定位的 VUBP基因为1或2个
串联和片段复制是植物基因家族扩展的两个主要原因，使用MCScan X2对 VVUBP基因家族进行共线性分析,共观察得到2段重复基因段,分别是位于 14号染色体的 WUBP21和17 号染色体的 WUBPI7
由图4可知，VUBP基因的启动子上显示了对脱落酸、水杨酸 茉莉酸甲醋生长素和赤霉素等激素响应的顺式元件每人 WUBP基因启动子均含有光响应元件,可能参与了光信号对葡萄生长发育的影响，有 9个WUBP基因含有富含TC的元件,可能在防御方面发挥作用，VDUBP基因可能在激素响应和协迫响应中发挥作用
大多数 WUBP基因在不同组织间广泛表达，但UBPs在艺中的表达水平相对较低
然而WeUBP21、WUBP15和 WUBP7在种子中表达量相对较高，WUBP27和 UBP23 分别在卷须中和叶中表达水平较高,UBP10在花中表达水平较高
与对照组比较，WUBP基因易受到生长调节剂影响，外源MeJA处理5 min后.WUBP基因的表达量显著增加，短暂增长后开始下降,其中有 8个WUBP在 6h时增长至最高.其中 UBP5 WUBPI2、WUBPI8和WUBP27增长最为明显
外源SA处理,有7个基因出现了短暂上调，而 WUBP15在处理后的6-8h出现显著上调
最后发现，WUBP5和 UBP19启动子序列上含有 TCA元件,并对SA具有较高的敏感性，由此推测 WUBP5和 WUBP19可能通过SA信号传导途径参与了葡萄响应的非生物胁迫
结论葡萄在栽培的过程中经常遭受各种非生物胁迫侵害,导致产量损失巨大
UBP基因家族是蛋白质泛素化和去泛素化过程中的关键蛋白酶,通过水解同脑键,从而回收游离泛素逆转泛素化反应,该过程在许多植物响应非生物胁迫过程中起到关键作用
迄今头止,葡萄UBP基因家族所受关注较少，因此本研究些别了葡萄基因组中 WUBP家族成员，并识别其功能上的潜在差异，同时运用RT-PCR 技术分析在不同非生物胁迫处理下 WUBP的表达模式恋化
我们监定得到27个WUBP基因,鉴定出的 WUBP数量与AtUBP数量相近
系统发育分析结果表明，多数 WUBP与AUBP 具有较高同源性，说明 WUBP 和AtUBP可能具有类似的功,启动子中的顺式作用元件在基因转录起始调控中起重要作用.其分布规律揭示了蛋白功能和调控水平的差异
顺式元件分析结果表明.WUIBP启动子区存在多种与生长发育、植物激素和逆境胁迫响应相关的顺式元件.推测葡萄 UBP可能在非生物胁迫过程中起到重要作用
对VvUBE蛋白进行了亚细胞定位预测,有助于了解VVUBP的功能及其发挥作用的场所，对VvUBP进行的亚细胞定位预测分析,结果显示一些VVUBP蛋白定位于细胞核中,表明这些VvUBP蛋白可能作为转录因子
随着分子生物学技术的不断发展与提高,研究人员对于植物适应逆境和抵御逆境机制的探索开始从生理水平逐步进人分子水平[23]
植物激素如茉莉酸和水杨酸是植物次生代谢中独立且协同作用的信号分子
这两种信号分子与植物对抗逆境密切相关.可激活植物的应激防御反应[2-27]
植物激素在调节植物病原体的防御机制中起着重要作用
在脱落酸、茉莉酸甲醋和水杨酸外源处理下，一些PeUBP成员显著上调，其中PHO2Cene33419.t1在 MeJA处理后表达水平急剧上升,表明PHO2Cene33419.tI 可能参与植物免疫并在毛竹抗逆胁迫中发挥着重要作用，为了进一步闸明 WUBP在葡萄中发挥的作用,对其在不司生长调节剂处理下的表达模式进行了分析，在 MeJA 处理下 WUBP基因均出现短暂上调，其中WUBP5在 MeJA 处理4和6 h 的表达量分别是对照组的20和40倍，而在 SA处理下，WUBP5的表达水平同样明显高于对照组
因此推测 VvUBP基因家族在抗逆胁迫中发挥重要作用
植物可在弱光、盐和高温等胁迫环境下激活特定应激防御反应，这些环境因素与植物抗逆过程息息相关
光是植物光合作用的重要因素,对植物生长起着重要的影响作用
多项研究表明,在不同植物中UBP基因的表达受环境条件的诱导，当植物处于弱光环境中的时间越长,光合作用下降越明显.恢复正常生长所需的时间越长，在烟草中共鉴定出59 个 MUBP家族成员，在表达分析中表明了NtUBP基因家族成员响应光、冷和干旱胁迫，证实了UBP基因家族在抗逆胁迫中起着重要作用