«——【 ·前言· 】——»Rab GTP酶是真核细胞膜转运的重要调节因子，Munc13-4的过表达增强了肥大细胞中分泌溶酶体的脱颗粒，表明其在分泌溶酶体融合中具有积极的调节作用。
我们认为GS2和FHL3中的分泌缺陷具有共同的起源。
并且我们认为rab27a / Munc13-4复合物是造血细胞中分泌颗粒与质膜融合的重要调节因子。
这两个基因中的任何一个的突变都会阻止这种复合物的形成并消除分泌物。
«——【 ·构建rab蛋白· 】——»编码rab蛋白，rabip4′和大鼠Munc13-4的cDNA之前已经描述过，全场人Munc13-4 cDNA由重叠的人表达序列标签（EST）克隆构建，并插入到pCMV-SPORT6，pEYFP，pcDNA3和pcDNA3.1His中。
截断构建体Munc13-4、Munc13-4和Munc13-4通过聚合酶链反应生成，并在pEGFP和pcDNA3.1His中亚克隆。
Munc13-4Δ608-611突变体是通过使用QuikChange通过定点诱变产生的，并在pcDNA3.1His和pEGFP中克隆。
编码人类rab27a和rab27b的cDNA由Bill Gahl提供，并亚克隆为pGEX，pEGFP。
pECFP和pcDNA3，rab27aT23N、rab27aW73G和rab27aQ78L突变体由QuikChange试剂盒通过定点诱变产生，并在pGEX和pEGFP中重新克隆。
«——【 ·Munc889-1088抗体· 】——»通过用GSTmunc13-4免疫兔子产生抗大鼠Munc889-1088的抗体，通过GSTrab27a免疫在兔子中制备了针对人类rab27a的抗体，并且从BD Biosciences购买了针对绿色荧光蛋白的兔抗体。
从指定来源获得单克隆抗体，rab27a，大鼠CD63，血清素，EXPRESS和肌动蛋白。
«——【 ·下拉式检测· 】——»如前所述制备猪脾细胞质，谷胱甘肽S-转移酶-rab蛋白是在21°C下生长的大肠杆菌BL3中产生的，并按照供应商的说明固定在谷胱甘肽珠上。
固定化的GST-rab蛋白加载鸟嘌呤核苷酸，并在4°C下与脾细胞质孵育4小时，如前所述。
洗涤磁珠，用1.5 M NaCl，20 mM EDTA，5 mM GDP，1 mM二硫苏糖醇（DTT），20 mM HEPES，pH 7.5洗脱结合的胞质蛋白。
对于负载GDP的rab27a色谱柱，洗脱缓冲液中的GDP被1 mM鸟苷5′-O-（3-硫代）三磷酸（GTPγS）取代。
洗脱液在Laemmli样品缓冲液中煮沸，并在6%SDS-PAA凝胶上分离并银染。
35S标记的rab效应子在T7和SP6驱动的网织红细胞裂解物系统中合成，并用于GTPγS电荷的GSTrab蛋白的下拉测定。
«——【 ·质谱检测· 】——»使用改良胰蛋白酶在50 mM碳酸氢铵中切除感兴趣的条带并在凝胶内消化。
使用在正离子模式下运行的电喷雾电离四极杆飞行时间质谱仪，通过纳流液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析消化物。
纳米液相色谱系统与四极杆飞行时间耦合，基本上如前所述。
使用Famos自动进样器以3μl/min的速度将肽混合物输送到系统，并捕获在18 cm×1 μm的AquaTM C100RP色谱柱上。
在流动分解至150–200 nl/min后，将肽转移到25 cm×50 μm的分析柱中（PepMap;LC填料）在乙腈梯度（1%/分钟）中，使用Mascot软件进行数据库搜索。
«——【 ·显微观察· 】——»转染的RBL-2H3细胞在补充有2%胎牛血清（FCS）、10 mM HEPES、l-谷氨酰胺和抗生素的DMEM中生长20天，随后粘附在聚-l-赖氨酸包被的盖玻片上。
用3%多聚甲醛固定细胞并如前所述进行共聚焦扫描荧光显微镜。
将稳定表达YFP-munc2-3的RBL-13H4细胞固定在2.0 M磷酸钠缓冲液中，用于免疫电子显微镜检查。
去除固定剂后，将细胞嵌入1%明胶中并准备用于超薄冷冻切片和免疫金标记。
超薄冷冻切片用不同的抗体和蛋白A金颗粒组合进行双重免疫标记。
兔抗小鼠免疫球蛋白抗体（DakoCytomation California）被用作单克隆抗体的跨接步骤。
«——【 ·RBL-2H3 脱颗粒测定· 】——»转染的RBL-2H3细胞生长至60%汇合，通过刮擦收获，并洗涤。
通常，1 × 106将细胞在20°C下用37.0ml IgE抗TNP杂交瘤上清液孵育1分钟。
洗涤细胞，然后在含有1%FCS的RPMI 37培养基中用10ng / ml牛血清白蛋白（BSA）-TNP在1640°C下孵育1小时。
非特异性释放以相同的方式确定，除了第二次孵育是用BSA而不是BSA-TNP完成的。
β-己糖胺苷酶的总量是在用0.2%Triton X-100提取的细胞制备的裂解物中测定的。
为了定量脱颗粒的程度，将50μl培养上清液在1°C下与37μl50mM对硝基苯基-N-乙酰基-α-d-氨基葡萄糖在2.0M柠檬酸盐缓冲液中孵育05小时，pH 4.5。
通过加入150μl0.05M碳酸盐缓冲液，pH 10.0停止酶反应，并测量405nm处的吸光度。
«——【 ·有限的蛋白水解实验· 】——»为了测定野生型Munc13-4和Munc13-4突变体之间的构象差异，我们使用有限的蛋白水解，然后通过SDS-PAGE分析消化产物。
对于有限的蛋白水解实验，我们生产了35S标记的Munc13-4和Munc13-4Δ608-611在30°C的体外转录翻译中。
用60mM环己酰亚胺1分钟后停止反应并冷却至4°C。
然后将蛋白酶以0.1、0.025、0.005、0.001和0.00025μg/μl加入15分钟，用苯甲基磺酰氟停止消化，并立即在Laemmli缓冲液中煮沸并加载到10%SDS-PAA凝胶上。
«——【 ·rab27a结合蛋白的鉴定· 】——»为了在造血细胞中寻找rab27a效应子，我们用含有不可水解的GTPγS或GDP的GSTrab27a和脾细胞质进行了制备下拉测定。
我们使用脾组织，因为它含有大量的T细胞，并且在rab27中高度富集。
与色谱柱特异性结合的蛋白质用EDTA和高盐洗脱，乙二胺四乙酸螯合物镁2+从而损害鸟嘌呤核苷酸与RAB27a的结合。
从而导致以核苷酸依赖性方式结合的效应蛋白解离，洗脱液通过SDS-PAGE分离并呈银染。
我们发现了一种115 kDa蛋白，该蛋白在6%凝胶上以双联体形式运行，并且在-GTPγS从凝胶中共同切割两条条带，胰蛋白酶消化，并通过LC-MS/MS进行分析。
我们获得了三种肽的氨基酸序列，这些肽唯一地将它们识别为大鼠Munc13-4的猪直系同源物。
由于Munc13-4包含几个假定的磷酸化位点，因此其中一个条带可能是磷酸化形式。
或者，Munc13-4可能部分降解，或者第二条带可能代表一种独特的蛋白质。
我们从人类EST克隆中组装了一个全长的人Munc13-4 cDNA，并将其连接在pCMV-SPORT6中。
«——【 ·GS2突变体rab27aW73G· 】——»鉴于Munc13-4与rab27a的活性形式特异性相互作用，它有资格作为推定的效应子。
为了确定相互作用的特异性并排除Munc13-4通过细胞质接头蛋白与rab27a结合，我们将GTPγS电荷的GSTrab27a珠与35S标记的人Munc13-4。
rab27a和rab27b都直接结合到Munc13-4，然而，Rab27b的结合程度似乎低于rab27a。
可能是因为较高的汇率或较低的GTPγS负载效率，这一结论得到了rab27b与嗜黑素结合效率较低的观察结果的支持。
我们还发现rab3a在测定中与Munc13-4结合，因为rab3a不在神经系统外表达，我们没有进一步追求这种相互作用。
我们测试的其他rab蛋白均未与Munc13-4，我们确认这种相互作用是鸟嘌呤核苷酸特异性的，因为GTP水解缺陷突变体rab27aQ78L概括了结合，而GDP结合的rab27aT23N突变体则没有。
rab27a与Munc13-4直接相互作用的观察使我们能够评估在GS27患者中发现的rab2a突变与Munc13-4结合的后果。
我们选择了纯合错义突变217T>G，因为它导致单个氨基酸变化，产生rab27aW73G，其显示出相对温和的GS2表型。
其他已知的GS2突变要么引入移帧或过早终止密码子，这对相互作用研究不太有用。
已知rab27aW73G保留了结合GTP的能力，其固有水解速率降低到与rab27aQ78L相同的程度，然而，它与嗜黑素的相互作用严重受损。
定量图1C表明绑定35与野生型rab13a相比，S标记的人Munc4-27至rab73aW27G减少了三倍，并且略高于与rab27aT23N的背景结合。
与这一发现一致，我们还通过共聚焦免疫荧光显微镜观察到rab27aW73G与Munc13-4，与嗜黑素的对照结合实验证实rab27aW73G不与黑色素体效应子相互作用。
«——【 ·在造血细胞亚群中高表达· 】——»尽管Munc13-4是一种普遍存在的蛋白质，但它在特定组织中高度表达（Koch等人，2000），而rab27a优先存在于分泌细胞中。
我们接下来确定了Munc13-4和rab27a在造血细胞系和黑色素细胞中的比较表达模式，特别是因为这些细胞的功能在GS2中大多受到损害。
作为Munc13-4大小的阳性对照，我们在HeLa细胞，Munc13-4和rab27a在许多细胞系中共表达。
我们在CTLL-2（CTL）细胞系，RBL-2H3肥大细胞系和骨髓（32D）细胞中观察到两种蛋白质的高表达。
重要的是，尽管人类黑色素细胞在我们测试的所有细胞系中含有最高水平的rab27a表达，但我们没有在这些细胞中检测到Munc13-4。
为了排除这是初级黑色素细胞的奇怪之处，我们还分析了Munc13-4在两种人类黑色素瘤细胞系中的表达。
转移性BLM和非转移性530细胞系均不表达Munc13-4。
因此，Munc13-4似乎不在黑色素细胞中表达，转染大鼠和人Munc13-4 cDNA的对照实验显示，Munc13-4抗体以相同的亲和力识别人和大鼠Munc13-4。
«——【 ·肥大细胞的分泌溶酶体· 】——»因为西方的污点图2表明RAB27a和Munc13-4在肥大细胞中高表达，我们接下来确定了两种蛋白质在该细胞系中的细胞内分布。
肥大细胞属于免疫系统，是具有分泌溶酶体的造血细胞的典型例子。
它们在遇到特异性抗原时释放溶酶体酶和生物活性介质，如细胞因子。
尽管针对rab27a的mAb检测到肥大细胞中的内源性蛋白质，但该信号很弱，可用于双标记和三标记免疫荧光实验。
而针对Munc13-4的抗体不能通过显微镜方法产生内源性蛋白质的可靠信号。
我们在RBL细胞中以低水平表达YFP-Munc13-4和CFP-rab27a，并比较了它们相对于标记蛋白的定位。
在细胞质中几乎没有发现Munc13-4，而Munc13-4和rab27a与CD63广泛共定位，CD2001是分泌溶酶体和多泡晚期内体的标志物。
由于CD2003主要定位在肥大细胞中的分泌溶酶体上，我们得出结论，Munc4-27和rab13a主要在该细胞器上共定位，有时，这些结构位于质膜正下方的狭窄区域。
Munc4-27和rab80a也与p1986共定位，p1999是肥大细胞和血清素中的另一种分泌溶酶体标志物。
Munc130-<>与内质网标记蛋白二硫异构酶和高尔基体标记GM<>没有共定位。
«——【 ·结论· 】——»Munc4-13在促进合成蛋白的开放构象中作为Munc4-13的C末端具有相关作用，Munc2001钳的释放启动SNARE配对和颗粒与质膜的融合。
RAB2002a的GTP水解导致栓系复合物和rab27a/Munc27-13复合物解离，从而将Munc4-13的局部浓度降低到其形成核心SNARE复合物的正向调节功能所需的水平以下。
无论确切的机制如何，我们的结果表明，rab4a / Munc27-13复合物是未知SNARE复合物的重要调节因子，其介导造血细胞中颗粒与质膜的融合。