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文|辰彥语不休编辑|辰彥语不休前言在磷肥生产过程中，添加 humic acid 可以生产具有 humic acid 附加价值的磷肥，这可以提高磷肥利用效率和促进作物生长
尽管以前的研究主要致力于研究 humic acid 的结构和功能对磷肥中磷素的可利用性的影响，但是对磷肥结构的调控效应和微生物的协同机制研究较少
本研究旨在通过实施各种处理工艺来研究 humic acid 添加的磷肥效率提高的化学和生物学机制，这些工艺包括将 humic acid 物理混合到磷肥中(HA+P)、化学合成 humic acid 磷肥(HAP)、使用商用 humic acid 磷肥(SHAP)、普通的磷钾肥(P)和不添加磷肥的对照处理(CK)
一、材料准备从风化煤中提取腐植酸( HA )，将经过磨碎和筛选的风化煤与0.5 M NaOH 以 1:10 的固液比均匀混合
溶液在室温下搅拌24 h后，8000 r/min离心10 min除去杂质，得到腐植酸溶液
用 6.0 M HCl 将腐殖酸溶液的 pH 调节至 1，并将溶液静置 24 h
8000 r/min 离心 10 min，弃上清液，即得腐植酸粗提物，将粗提腐植酸与0
1M HCl+0
3M HF溶液混合均匀；固液比始终为1:10，摇动24 h，洗涤3次，去除无机物，提纯粗腐植酸
氯-去离子水洗涤3次，固液比1:10
将纯化后的腐植酸冷冻干燥得到腐植酸粉，干燥后贮存备用
物理复配腐植酸磷肥（HA+P）和化学合成腐植酸磷肥（HAP）供试肥的制备，在磷酸溶液中加入占磷酸溶液和氢氧化钾总质量10%的腐植酸材料（磷酸与氢氧化钾的摩尔质量比为1/2），搅拌均匀
加入氢氧化钾，经快速搅拌、研磨、过筛、干燥保存，经高温酸碱反应得到试验用腐植酸磷肥
腐殖酸裂解小分子可通过酸碱中和反应与磷酸结合生成新物质，由腐植酸制成的磷肥代号为HAP
二、表征方法扫描电子显微镜-能量色散光谱仪
使用扫描电子显微镜 (Hitachi S-4800) 扫描 HA+P 和 HAP 残留物的表面形态，并使用独立的能谱仪分析 HA+P 和 HAP 残留物以确定元素组成，使用红外光谱仪（Bruker VERTEX 70）分析供试磷肥的官能团结构
测试条件：将约2mg样品和200mg溴化钾混合压片，用FT-IR光谱仪记录样品在4000-400cm -1 波数范围内的红外光谱特征，使用OMINC 8.2软件进行光谱的基线校正和数据平滑校正
使用 Origin 2018 软件进行绘图
X射线光电子能谱
XPS（Thermo Scientific K-Alpha，美国）用于表征HA+P和HAP残留材料的组成以及各组分的化学状态，并定量分析各组分的含量
HA+P 和 HAP 残基的碳官能团的详细分布通过 NMR 技术 (Bruker 400 M) 阐明
碳类型分为烷基碳（C Alk，0-65 ppm），O-烷基碳（C Alk-O，65-100 ppm），芳香碳（C Ar-H，R，100-140 ppm）， O-芳香碳 (C Ar-O ，140–156 ppm)、羧基碳 (C COO-H，R ， 156–190 ppm) 和羰基碳 (C C=O ， 190–250 ppm)
三、微生物群落的高通量测序和生物信息学分析土壤微生物群落的检测是根据之前的研究进行的， 使用 FastDNA Spin Kit for Soil 从 0.5 g 新鲜土壤中提取土壤总 DNA
引物组 799F/1193R 和 ITS1f/ITS2 分别用于细菌 16S rRNA 基因 V5-V7 区和真菌 rRNA 基因 ITS（内部转录间隔区）的 PCR 扩增
25 μL PCR 系统包含 12.5 μL PCR 预混液、0.5 μL (10 μm) 正向和反向引物、0.5 μL DNA 模板 (20 ng/μL) 和 11 μL 无菌双倍-蒸馏水
PCR 是用热循环进行的，初始变性在 94°C ，10 分钟，30 个循环的变性在 94°C ，30 秒，在 55°C/56°C（16S rRNA/ITS）退火 45 秒，延伸72 °C 1 分钟， 72 °C 延伸 10 分钟
使用 VSEARCH 包进行生物信息学分析，配对末端读数被合并，低质量序列（每个碱基的错误大于 0.001 或长度 < 150 bp）被过滤
使用 UCHIME 算法 (uchime3_denovo) 检测并删除嵌合读数，使用 UNOISE 算法对高质量读数进行去噪，并生成 ZOTU（零半径操作分类单元）
ZOTU 的分类学分配是使用 Sintax 算法进行的基于 SILVA rRNA 数据库和 UNITE 数据库的参考，去除不能归类为细菌或真菌的 ZOTU 后，细菌和真菌 OTU 表分别精简到每个样本 130，000 和 85，000 读数，用于下游分析
PICTUSt2通过重建未观察到的状态对群落进行系统发育调查）用于预测细菌群落的功能概况，选择参与磷转化的基因来检测细菌磷转化功能潜力
四、计算与统计分析使用相应的软件分析表征结果，使用 R 包进行数据统计分析
单向方差分析用于检测治疗之间差异的显着性
使用“素食”库进行基于 Bray-Curtis 距离的主坐标分析 (PCoA)，以显示不同 P 处理下微生物群落之间的差异
使用“纯素”库确定微生物群落的 α 多样性
使用IBM Statistics SPSS 22
0软件（Duncan），所有数据均为三次观察的均值
五、合成肥料的结构表征在不同放大倍数的电镜扫描下，HA+P 和 HAP 表现出一定的差异，与 HAP 相比，表面更光滑，均表现出疏松丰富的孔隙结构，与以往文献报道的腐植酸结构相似， 将图像放大20，000倍对比HA+P和HAP，HAP表面网状结构较多，附着的矿物颗粒较多
在高温反应作用下，其表面形成许多凹陷的气孔，研究结果表明，HA+P与磷肥的化学结合过程增加了HAP的表面积并揭示了更多的结合位点，同时其无定形结构得到了很好的保留
另外，我们还使用红外光谱对合成材料进行了表征，所有三种肥料的 FT-IR 光谱都相似
3415 cm -1处的峰是由醇和酚中-OH 的拉伸引起的
2489 cm -1处的峰由于PO-H的拉伸而倾斜，1631 cm -1处的峰由于-COOH的振动拉伸而移动至1654 cm -1
另外，与P和HA+P相比，HAP在1101 cm -1处产生了一个新的振动峰，表明形成了一个新的化学键-O-
HAP峰在980-500 cm -1处的振动强度低于其他两种材料，表明 HAP 中灰分含量降低
这些FT-IR光谱结果表明，在HAP的高温制备过程中，腐植酸的主要官能团没有发生变化，通过键的断裂和生成产生了新的化学键-O-，与磷分子结合形成磷脂
六、腐植酸磷肥对磷有效性的化学增效作用机理腐植酸的添加对土壤有效磷含量影响较大，呈先升高后降低的趋势，这与土壤中磷的养分释放规律是一致的
与单施普通磷肥相比有明显提高，这是因为腐植酸中含有多种离子交换和吸附能力强的官能团，可以活化土壤中的不溶性磷，增加磷的有效性
HAP处理在不同采样时期均达到显着水平，与HA+P处理相比分别增加了13.8%、21.2%、47.7%和28.7%
土壤速效磷含量在第 12 天各处理均达到最大值，还影响磷的有效性和植物对磷的吸收，研究结果表明，施用腐植酸配制的腐植酸磷肥可提高土壤磷的有效性
HAP中K和P的重量比分别为2.9%和0.3%，低于HA+P，化学合成的腐植酸磷肥施入土壤后，会发生多种物理化学反应，使磷酸酯键断裂，释放出磷，增加土壤速效磷的含量
七、腐植酸磷肥提高磷效的生物学机理研究土壤中的细菌群落主要由黏球菌门、扁丝菌门、疣微菌门、厚壁菌门、芽单胞菌门、绿屈菌门、放线菌门、酸杆菌门、拟杆菌门和变形菌门组成，占97.02% (HA+P5)， 96.75% (HAP5)， 9 5.30 % (HA+P40) 和总社区的 96.49% (HAP40)
这些分类群的相对丰度在不同的处理和孵化阶段之间有所不同，PCoA 的二维图进一步描述了 HA+P 和 HAP 处理之间微生物群落的变化
在孵育初期，HA+P和HAP土壤细菌群落聚集在一起，表明两种处理的细菌群落相似性较高，经过 40 天的培养，两种处理之间的细菌群落差异很大
研究结果表明，尽管细菌分类组成在不同处理下变化不大，但细菌群落结构受到不同处理的明显影响
微生物是土壤磷转化的主要驱动力，功能预测的结果显示了 HA+P 和 HAP 对参与 P 转化的细菌功能谱的不同影响
对于编码有机磷矿化和无机磷溶解过程的单个基因，与 HA+P 处理相比，土壤中腐殖酸和磷肥化学的组合增加了植酸酶和 PQQGDH 基因的数量（P< 0.01)
与HA+P处理相比，编码碱性磷酸酶的基因数量增加了3.23%（HAP和HA+P处理的基因数量分别为60，327和58，439）
研究结果表明，HAP的添加增加了土壤中与磷转化相关的微生物数量，这可能是由于腐植酸肥料促进作物根系的生长发育，增加了作物根系及其渗出液的数量，改善土壤微环境，从而增加土壤中微生物的数量
八、 番茄植株生长及养分吸收分析Baghaie 等人表明添加腐植酸可以提高番茄植株的营养品质和果实产量，但没有研究HAP组合的结构变化是否可以促进番茄幼苗的生长
在本研究中，施用磷肥可以促进番茄幼苗的生长，增加其株高、茎粗和生物量
与CK相比，HA+P和HAP处理后株高分别增加10.3%和21.3%，HAP处理差异显着（P < 0.05）
HAP处理的茎粗较CK处理高15
31%，但差异不显着（P> 0.05)
HAP干重分别增加61.02%和177.18%，显着高于CK处理（P < 0.05）
相同腐植酸添加浓度下，HA+P和HAP处理对番茄植株的刺激效果相似，但差异无显着性（P > 0.05）
另外，HAP处理的番茄茎叶叉较多，生长状况明显优于其他处理
施磷肥有利于植株养分积累，各施磷处理均增加番茄植株地上部和地下部磷钾含量，但对氮素含量影响不显着番茄植株各部位( P > 0.05)
与其他施磷处理相比，HAP更显着促进了番茄对P和K元素的吸收，地上部P和K元素的积累量分别达到1.49 g·plant -1 和16.05 g · plant -1，与 Jing 等人的结果一致
HAP 处理在地下具有最高的磷积累，SHAP处理番茄吸磷量最高（2.50 g·plant −1），较CK处理显着提高38.89%（P < 0.05），其他处理与CK无显着差异处理（P > 0.05）
腐植酸能刺激作物的根系生长，这与腐植酸的类生长素作用有关，通过促进根系伸长促进对养分的吸收
总结在 humic acid 磷肥(HAP)制备过程中高温生成时,在 1101 cm−1 出现新的吸收峰,生成了新的化学键(-O-)
humic acid 中的羟基与磷酸结合形成磷酸酯(P-O-C=O)结构
HAP 残留物在土壤表面富集,吸附更多的矿物质
高活性含氧官能团(如芳香族 C-O、羧酸/酰胺碳和羰基碳)的含量显着增加,而烷基碳、氧烷基碳和芳香碳的含量减少
humic acid 与磷酸钾结合时,羧基和钙离子形成 HA-m-P 复合体,使土壤中可溶性磷(H2PO4−)的含量增加 1.71%
与 HA+P 相比,HAP 处理显著增加土壤中可利用 P 含量 13.8-47.7%(_P_<0.05)
HAP 处理下,植株高度、茎径和地上生物量分别增加 21.3%、15.31% 和 61.02%,总 N、P 和 K 营养元素积累量增加 6.71%、31.13% 和 41.40%,与对照相比
高通量测序结果显示,HA+P 和 HAP 处理的根际土壤富集细菌群,土壤微生物结构发生变化,HAP 处理下细菌群落多样性增加
与磷转化相关的碱性磷酸酶和生物素酶的基因数量分别增加 3.23% 和 2.90%
humic acid 磷肥在化学制备过程中形成磷酸酯
应用后,土壤微生物群落结构发生变化,与磷转化相关的土壤酶活性提高,促进番茄对土壤养分的吸收,从而促进番茄植株生长和营养积累
参考文献【1】李， BY; 周，DM；苍，L.张红莲；范晓华；Qin， SW 受长期无机肥和有机肥施用影响的土壤微量元素对作物的有效性.土壤耕作研究.2007 ， 96 ， 166–17.【2】巴罗，新泽西州土壤磷酸盐化学和以前磷酸盐应用的磷节约效应.植物土壤 2015 年，397，401–409.【3】巴莱米，T.Negisho， K. 土壤磷管理和植物对可持续作物生产磷胁迫的适应机制：综述.J. 土壤科学.植物营养素 2012 ， 12 ， 547–561.【4】姆潘加，IK；美国路德维希；香港达巴；Neumann， G. 受土壤 pH 值影响，在玉米中联合施用铵肥和解淀粉芽孢杆菌 FZB42 获取磷矿粉.J.申请.微生物学. 2020 ， 129 ， 947–957.