作者：朱晨迪，杨婷婷，尹金风，姜慧，Howard E. Takiff，高谦，柳清云，李卫民第一作者及单位：朱晨迪 首都医科大学附属北京胸科医院通信作者及单位：柳清云，哈佛大学陈曾熙公共卫生学院；李卫民，首都医科大学附属北京胸科医院The Global Success of Mycobacterium tuberculosis Modern Beijing Family Is Driven by a Few Recently Emerged StrainsMicrobiology Spectrum, Spectr: e0333922.doi: 10.1128/spectrum.03339-22.PMID: 37272796.研究背景全球结核病的传播受到少数传播能力较强的结核分枝杆菌复合群（MTBC）菌株影响
北京家族[结核分枝杆菌谱系2（L2）]菌株因其高传播力、高毒性以及与耐药相关而受到广泛关注
以往的研究观察到全球超过70%的北京家族菌株源自现代北京家族（L2.3）
然而，目前尚不清楚哪些菌株导致了L2.3的全球扩张，以及它们的进化轨迹
通过识别导致全球扩张的菌株并追踪其进化，有助于理解高传播性的本质，并制定有效的控制策略
在这项研究中，我们收集了来自全球51个国家的超过62项研究的7896株L2.3临床分离株的全基因组测序（WGS）数据
通过群体遗传学的方法，确定了导致北京家族全球扩张的亚型，并阐明了驱动L2.3全球扩张的进化机制
研究方法1.MTBC L2.3菌株的基因组序列收集：我们在PubMed中检索了2005—2020年发表的包含全基因组测序数据的文章，并纳入了包括从亚洲、欧洲、大洋洲、非洲和美洲共计51个国家超过62项研究的7896株MTBC L2.3菌株的WGS数据
2.进化枝定义：我们根据以下标准定义了L2.3进化枝：（1）在系统发育树中形成单系进化枝的分离株；（2）进化枝中bootstrap支持度＞90；（3）1个进化枝内的所有分离株至少共享1个其他进化枝中不存在的共同分枝长度（SNP）
3.多样性分析：（1）成对SNP距离：我们编写了一个Perl脚本来计算所有菌株对之间的SNP差异，并根据6和12个SNP的阈值进行聚类分析
（2）末端分枝长度：我们编写了一个脚本来计算每株菌株从共同祖先分化后积累的SNP数量，作为末端分枝长度（TBL）
使用Python（版本3.7.0）中的Kolmogorov-Smirnov检验比较不同进化枝之间的末端分枝长度
（3）样本多样性与生物地理学：我们利用Mega X软件来评估从不同地理区域收集的每份样本的多样性（π）
并计算每个区域的多样性（π）与其距源的地理距离之间的线性相关性（r2）
4.群体遗传分析：（1）起源分析：RASP软件用于估计 MTBC L2.3 的祖先地理范围
（2）祖先推断：使用PAML软件重建进化枝L2.3.1～L2.3.6的祖先序列
（3）群体扩张与时间分析：我们使用BEAST（版本 1.8.0）估计了L2.3及其子系最近共祖出现的时间
并应用贝叶斯天际线图（BSP）分析来估计6个 L2.3 进化枝过去的有效种群规模动态
（4）全球迁移率：迁移事件被定义为从亲本菌株最可能重建的祖先地理区域到后代节点菌株的不同地理区域的变化
每个分枝随时间的迁移率是通过对时间尺度系统发育中每年发生的迁移事件的数量进行求和来推断的
5.基因富集分析：使用在线软件David（https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp）对每个进化枝的私有突变进行GO和KEGG富集分析
研究结果我们收集了7896株L2.3分离株的全基因组序列
这些L2.3菌株按照大陆的分布如下：亚洲3805个，欧洲2945个，非洲652个，大洋洲236个，北美洲/南美洲258个（图1A）
我们还比较了L2亚型（L2.1、L2.2和L2.3）的相对流行率，发现在非东亚地区分离的L2菌株中，94.1%属于L2.3，而L2.1和L2.2亚型仅占L2菌株的5.9%
这与之前的估计相一致，即全球流行的大多数L2菌株属于L2.3亚型
先前的研究提示L2.3起源于东亚
为了更详细地了解L2.3菌株的进化起源，我们将来自东亚的L2.3菌株分为南部和北部两个区域（图1A）
RASP地理起源重建分析表明，L2.3菌株起源于东亚北部（后验概率：91.0%）
同时，我们估计L2.3亚型的最近共同祖先（MRCA）时间约为591（95％CI：292～808）年前（图1B）
我们进一步将L2.3分为了6个进化枝（L2.3.1～L2.3.6）（图1B）
进化枝L2.3.4～L2.3.6分别占总数的24.8%、25.3%和28.1%，而L2.3.1～L2.3.3进化枝仅占总数的7.5%、3.8%和10.5%
为了探究进化枝间流行差异的原因，我们使用贝叶斯天际线图来追踪6个L2.3进化枝的历史种群动态，表示为有效种群规模（Ne）
我们发现，进化枝L2.3.1～L2.3.3的Ne随着时间的推移保持平稳，而L2.3.4～L2.3.6的种群似乎经历了多个主要扩张时期
我们计算了每个进化枝的有效种群扩张率（RNe），发现进化枝L2.3.4～L2.3.6的RNe明显高于进化枝L2.3.1～L2.3.3（P =0.002）（图1C）
为了更好地表征传播动力学的差异，我们计算了每个L2.3进化枝的系统发育树上的TBL与成簇率（图2A）
我们发现进化枝L2.3.4～L2.3.6的TBL明显短于进化枝L2.3.1～L2.3.3（P < 0.001）（图2B），并且在6与12个SNP阈值下，L2.3.4～L2.3.6分枝具有较高的成簇率（6-SNP，P = 0.003；12-SNP，P=0.002）（图2D，2E），表明进化枝L2.3.4～L2.3.6中的MTBC菌株的广泛流行可能是最近传播的结果
在本研究收集的所有L2.3菌株中，约84.8%（6693/7896）属于L2.3.4～L2.3.6分枝
相比之下，属于L2.3.1～L2.3.3分枝的菌株仅占15.2%（7896株中的1203株）
L2.3.4～L2.3.6分枝在全球广泛流行表明它们可能具有更高的跨境传播潜力
因此，我们使用BEAST追踪各国传播的时间，并根据系统发育树分枝上MTBC菌株的多国起源定义“跨境传播事件”
我们发现中国与东南亚的传播更为频繁，俄罗斯传播到欧洲和中亚的频率更高
英国似乎是跨境传播的中心，可能与其是移民大国有关
此外，我们还发现L2.3.4～L2.3.6进化枝的遗传多样性随着距离东亚的地理距离的增加而降低，其中超过50％的方差仅由地理因素解释，具体见图3
最后，我们对L2.3.4-L2.3.6可能的遗传机制进行了推测
由于进化枝L2.3.4～L2.3.6共享一个祖先，我们提出了两种假设：（1）奠基者效应，即进化枝L2.3.4～L2.3.6的共同祖先获得了适应性突变，使得3个进化枝具有相同的传播优势；（2）平行进化，即3个进化枝平行进化，但可能通过不同的突变路径提高传播性
与奠基者效应一致，进化枝L2.3.4与L2.3.5具有相似扩张动态模式的次要祖先节点，我们发现L2.3.4和L2.3.5后代的地理分布或种群规模几乎没有差异
然而，进化枝L2.3.6具有明显的次要祖先节点，仅在最近分叉的节点中具有明显的扩展，并且分布在地理上受到限制
这些结果表明，L2.3.4与L2.3.5的传播优势很可能是由它们的共同祖先获得的，而L2.3.6的传播成功可能仅是最新进化节点获得突变的结果
具体见图4
结 论我们发现L2.3亚型可以进一步分为6个不同的进化枝（L2.3.1～L2.3.6），而北京家族的全球传播主要归功于3个最近出现的分枝（L2.3.4～L2.3.6）的传播成功
高传播性的MTBC 菌株在全球结核病流行中发挥着重要作用，因此，了解传播的功能和分子基础有助于制定有针对性的结核病预防和控制策略