费尔南德斯，扫描探针显微镜软件和纳米技术工具2007年拉维涅，人细胞培养及细胞外基质合成与质谱直接分析相容的材料2010年索斯尼克A，塞夫顿甲基化泊洛沙胺增强细胞粘附2006年韦弗，聚乙烯醇冷冻支架的力学评价2010年（图片来源网络，侵删）
文|月明照影编辑|月明照影«——【·前言·】——»裁剪生物材料和周围组织之间的界面相互作用，是医疗设备设计要考虑的一个重要方面，聚乙烯醇(PVA)水凝胶具有适合于各种生物替代品的力学性能，但其表面缺乏细胞粘附性往往是一个问题常见的方法是通过混合或偶联的方式将生物分子结合在一起，但这些修饰破坏了PVA分子内和分子间的相互作用，从而导致其原有的，机械性能丧失在这项工作中，辉光放电等离子体的表面改性技术，已知只修饰表面而不改变体积性质，研究了促进细胞附着在聚乙烯醇基板上，进行了N2/H2微波等离子体处理，研究了聚乙烯醇表面的化学成分，等离子体处理膜的x射线光，电子和傅里叶变换红外分析显示，PVA的主要结构没有变化，但羰基和氮基团的存在使等离子体修饰导致，PVA表面润湿性增加，而表面粗糙度没有显著变化与未处理的PVA相比，血浆修饰膜可以成功将小鼠培养成纤维细胞和人内皮细胞，结果表明，该接枝在复水化后是稳定的，具有良好的细胞粘附性能，因此，PVA的血浆胺化是一种很有前途的方法，可以改善细胞与合成水凝胶接触时的行为«——【·PVA管状移植物的可行性·】——»植入小鼠后，这些支架没有出现破裂、撕裂或动脉瘤为了限制血栓形成过程，将假体内壁内皮化可以提高其血液相容性和长期生存能力然而，聚乙烯醇因其亲水性而难以支持细胞粘附和扩散，可以考虑两种方法来增加润湿性和细胞粘附性:大分子混合和化学改性，聚乙烯醇与纤维连接蛋白、壳聚糖、肝素等生物大分子的共混是非常有吸引力的，因为这些成分具有内在的生物学特性，有利于细胞的粘附和增殖不幸的是，尽管PVA支架对细胞的行为有所改善，但其机械性能却受到了严重影响事实上，PVA分子内相互作用受到另一大分子存在的严重损害，同样，通过化学修饰的PVA聚合物链功能化导致分子内相互作用的变化为了保持整体性能，pva基材料的表面改性似乎是可取的，因此，在本研究中，我们建议利用血浆诱导的功能化来改善PVA支架上的细胞附着，的确，它是一个在生物医学领域中，对生物材料表面进行修饰而不影响其整体特性的公认技术此外，它是一个无溶剂的过程，并导致消毒表面，因此，等离子体表面改性，可能是常规PVA化学改性的有效替代方法，常规PVA化学改性需要多步反应，并使PVA适应恶劣条件， 此外，等离子体修饰可以通过改变等离子体参数，胺化对细胞的粘附、扩散和生长都有有益的影响，因此，这项工作的主要目的是证明使用H2 /N2等离子体处理可以成功地获得PVA支架的胺化由于H2 /N2混合物毒性较小，因此这种气体混合物有利于简单氨，并且气体成分也可以调节，从而影响表面的润湿性在这项研究中，使用了由三甲基磷酸钠化学交联的具有适当机械性能的PVA水凝胶，如前所述，用于血管置换利用x射线光电子能谱、傅里叶变换红外分析、接触角测量和原子力显微镜对表面改性进行了研究，最后，通过细胞定量和荧光显微镜观察成纤维细胞和内皮细胞在原膜和血浆修饰的PVA膜上的粘附和形态«——【·PVA底物的等离子体功能化和化学表征·】——»本研究用的PVA膜是用STMP作为羟基间的交联剂，通过铸造法制得的经XPS证实，薄膜主要由碳和氧组成然而，未经处理的PVA膜的氧碳比低于理论值，分别为0.4和0.5，这可以通过交联过程来解释，其中来自交联剂STMP的元素磷和钠原子也被检测到，等离子体处理后，PVA膜上掺入了约6%的N导致O/C比略有下降，这是由于氧被氮组分取代N1s的高分辨率光谱无法区分接枝在表面上的氮种类，因为它们的化学位移没有显著差异，因此，胺接枝是通过化学衍生化来评估的，由于氯苯甲醛在衍生化反应中与胺发生特异性反应，用XPS检测改性表面的氯量可以定量接枝胺在天然PVA膜上未检测到胺基，而在等离子处理的膜上估计有3.4%的胺基该值对应于氨基相对表面浓度为0.5-2胺/nm229请记住，最初只接了6%的氮，胺特异性在~55%的NH2 /N下是有效的，与文献中描述的最高值~66%相似，C1s的高分辨率光谱证实了PVA的主要化学结构没有变化，确实，CH2和CH-OH分别在285.0 eV和286.5 eV的初始PVA的两个特征波段没有受到等离子体处理的影响还应该注意的是，在等离子体处理过程中，酰胺和羧酸基团的掺入，分别在287.9 eV和289.5 eV时，它们的特征波段增加，这些观察结果在FTIR光谱中也被注意到，分别在酯羧酸和酰胺基团的1743 cm−1、1705 cm−1和1664 cm−1波段的羰基区域检测到的PVA的主峰没有变化，这意味着PVA的主要成分和链相互作用在整体上没有变化，事实上，FTIR深度分析比XPS更深，分别为1 μm和~5 nmXPS和FTIR分析都证明了等离子体表面修饰是一种有效的方法，可以在不影响其主要化学结构和链相互作用的情况下在PVA水凝胶上接枝氨基，此外，与未经处理的基材相比，等离子体修饰的基材的FTIR光谱显示OH/NH官能团的振动带强度更高，这表明PVA膜上的亲水性部分增加物理表面性质，通过接触角测量来研究等离子体处理的PVA基板的亲水性程度，观察到等离子体修饰导致的润湿性显著增加:未经处理的PVA基板的接触角为40.0°±2.4，表面修饰后降至18.1°±2.1，接触角值可以直接与在表面上产生的物种相关然而，在等离子体治疗过程中有两个主要过程可能发生:添加新的极性基团导致接触角降低，而蚀刻过程引起相反的效果，因此，正如XPS和FTIR分析所显示的那样，等离子体处理后PVA薄膜上观察到的接触角值的重要下降可以用聚合物表面上新的极性基团如酰胺和胺的存在来解释尽管PVA处理后的膜上有许多小的圆形结节，但在20 × 20 μm2和5 × 5 μm2的面积上，等离子体修饰前后的膜显示出相似的粗糙度，与先前报道的底层物质相比，这些结节是由于这些高度亲水性碎片的链断裂和重组造成的尽管链断裂，碎片足够长，因为它们留在表面上，而蚀刻过程中，聚合物断裂导致小碎片从表面移除，因此，可以假设聚合物表面没有被等离子体条件蚀刻，PVA处理膜的亲水性主要是由于表面功能化所致相比之下，Lee等人在PVA基板上用氨水等离子体处理后没有注意到接触角值的任何变化因为他们的工艺主要是诱导蚀刻在他们的研究中，样品在放电中直接用高能物质进行的，这意味着这些物质会失去能量，无法到达表面，因此减少了蚀刻，等离子体处理PVA底物的效率在化学修饰方面得到了明确的证明，在不改变体组成的情况下，将3.4%的氨基附着在表面在不影响表面形貌的情况下，薄膜的亲水性得到了提高，因此，可以考虑修饰表面对细胞行为的影响细胞培养，分别培养小鼠成纤维细胞和人内皮细胞，研究细胞在天然和血浆处理的PVA基质上的粘附和增殖，底物预先涂上血清，以便在更现实的条件下测试表面，因为人类血液中有许多蛋白质此外，已知表面修饰会影响蛋白质的粘附和结构以及细胞的附着，因此用血清预涂是更现实的方法将细胞接种于表面后，用荧光显微镜观察细胞在第1天和第3天的行为，并用绿色荧光标记活细胞进行观察，此外，在血浆修饰的PVA底物和未处理的对照底物上进行细胞计数，并在第1天和第3天进行比较对于两种细胞类型，在第1天，在未修饰的PVA膜上观察到很少的细胞，然而，在第1天，在血浆处理的PVA表面观察到更高的细胞密度，从第1天到第3天，细胞覆盖率总体增加为了进一步研究细胞接触特性的这些变化，我们通过测量细胞面积和细胞圆度来评估细胞的扩散，培养3天后，细胞核和胞质f -actin荧光染色显示内皮细胞整体形态，未经处理的PVA上的细胞保持圆形，而在等离子体处理的PVA上培养的大量细胞平坦且分布良好，呈多边形形状，这表明胺的存在有利于细胞最初的附着等离子体处理后的细胞面积和形状与对照组有显著差异，平均细胞面积分别为509±108 μm2和684±130 μm2，此外，与细胞圆度相关的形状因子，未处理的PVA为1.15±0.01，而等离子体处理的PVA基质为1.43±0.28细胞培养结果也证明，在等离子体处理的底物表面可以形成均匀的单层内皮细胞因此，基于我们实验室先前的工作，胺接枝的PVA水凝胶似乎是血管生物材料的有前途的支架未来的研究将探讨这种材料的血液相容性，表面表征和细胞相容性结果表明，由于表面胺基的存在，PVA底物的细胞接触性能显著提高最近对各种合成底物的研究也表明，含氮基团，特别是胺和酰胺官能团，是粘附蛋白吸附和细胞粘附的最佳选择，大多数作者将观察到的增强归因于亲水性和表面电荷增加的结合，细胞-底物粘附是一个包含几个步骤的过程，包括细胞外基质蛋白在表面的吸附，细胞通过整合素对ECM成分的识别，细胞骨架重组和整体细胞扩散大部分细胞、血清和ECM蛋白被认为是带负电的，因此它们往往通过静电相互作用在带正电的表面上被更多地吸附胺基在生理pH值下质子化，可以与带负电荷的蛋白质或和细胞膜的蛋白聚糖相互作用因此，在细胞附着的早期阶段，胺可能会增强培养基对蛋白质的吸附，以及随后贴壁细胞与被吸附蛋白质层的细胞相互作用等离子体技术通常观察到的一个缺点是处理过的表面在老化和洗涤方面的稳定性有限当设计一种最终必须被储存、消毒和植入的生物材料时，这一点尤为重要等离子体制备的胺接枝表面的老化行为已经被广泛描述，并且通常是由于等离子体后氧化和表面重排，Latkany等氨等离子体处理在PVA底物上接枝氮素对增强细胞黏附效果不显著事实上，他们说接枝的胺基是不稳定的在这里，我们证明了我们的氮等离子体接枝在PVA表面上足够稳定，在紫外线杀菌，再水化和随后的细胞培养后显示细胞粘附性能，此外，固定高度化学反应的基团，如胺，将允许随后接枝生物活性分子，以适应特定的需要，如粘附肽«——【·PVA薄膜制备·】——»常用的化学试剂可在体内进一步浸出并诱发继发性反应为了避免这些并发症，我们使用了三甲基磷酸钠作为化学交联剂，因为它已经被接受用于食品应用聚乙烯醇薄膜是用前面描述的铸造方法制备的简单地说，PVA无需进一步纯化，只需要溶解在去离子水中，90℃搅拌至完全溶解将溶液冷却至室温，搅拌下加入300 μL, 15% w/v的STMP，然后滴加氢氧化钠，将4克混合物倒入直径90毫米的聚苯乙烯培养皿中，在室温下保存至完全蒸发，得到的薄膜用去离子水洗涤以去除残留的氢氧化钠和STMP等离子体处理干燥的PVA薄膜放置在公司的商用微波等离子体反应器中，表面活化在等离子体下游区域进行，由高纯度氮和氢组成，在300 W, 2.45 GHz, 500 mTorr下进行5分钟化学表面分析，采用PHI 5600-ci型XPS仪对其表面化学成分进行了研究光谱仪，用1486.6 eV的标准铝x射线源和1253.6 eV的标准镁x射线源在无电荷中和条件下记录了高分辨率光谱，光电子检测一般在相对于表面平面45°处进行采用氯苯甲醛气相化学衍生技术对血浆处理后的PVA样品的胺表面浓度进行定量分析，然后进行XPS分析，这种衍生化技术在其他地方有更详细的描述简而言之，它包括在含有不存在于被处理表面成分中的原子的分子和感兴趣的表面化学功能之间进行化学反应，该添加原子的浓度由XPS测量，可以直接联系到反应官能团的相对浓度使用Nicolet Magna 550配备氘化三酸甘酯探测器，通过FTIR测定膜成分衰减全反射模式与带有硅半球形内反射元件的分裂豌豆附件一起使用，最大分析深度为估计为1μm，在4 cm−1的光谱分辨率下获得了150次扫描表面特征采用DimensionTM 3100原子力显微镜在刻硅尖端的攻丝模式下研究薄膜表面形貌，采用均方根粗糙度参数计算20 × 20 μm2和5 × 5 μm2区域的表面粗糙度，39 .利用WSxM软件进行形态学的可视化和分析使用VCA 2500 XE系统记录样品的静态接触角测量将3 μL的去离子水沉积在干燥的薄膜表面，5秒内拍摄照片在每个样品的不同部位随机沉积三滴，测量接触角，然后进行三次重复分析，细胞培养，PVA和等离子体处理的PVA薄膜被打孔到磁盘中，并放置在24个孔板中紫外线照射15分钟后，将膜在PBS中再水化2小时，在每个膜的顶部放置一个聚四氟乙烯o型圈以防止漂浮，成纤维细胞系用含有10%小牛血清和1%青霉素/链霉素/两性霉素B的Dulbecco 's Modified Eagle Medium在37℃、5% CO2条件下培养细胞被播种在薄膜上，并在培养中维持3天，内皮细胞培养按照相同的方案，使用EAhy进行研究，926细胞系添加DMEM，添加10%胎牛血清和次黄嘌呤/氨基蝶呤/胸苷播种前，用CS或FBS在37℃下涂膜1小时，在第1天和第3天，用calceinAM在37℃下孵育1小时，用尼康Eclipse E400荧光显微镜观察活细胞，用数码图像定量细胞活力，然后，用多聚甲醛固定样品，用Triton X-100渗透细胞，用DAPI染色细胞核，用Phalloidin-TRITC染色细胞质f -肌动蛋白细胞的面积和周长使用Archimed和Adobe Photoshop软件对数字图像进行人工测量，如果将细胞视为面积相似的圆，则细胞形状因子定义为实际周长与表观周长之比:S = P/[2 × (II × A)]1/2，其中S:形状因子，A:细胞面积， P:细胞周长统计分析，数据以均数±标准误差表示，细胞培养结果采用非参数KruskalWallis单因素方差分析和Dunns事后检验进行分析，形态学数据采用非配对学生t检验评估，p < 0.05为差异有统计学意义«——【·结论·】——»在本研究中，我们证明了H2 / N2等离子体处理可以成功地修饰化学交联的PVA水凝胶，从而改善细胞的粘附和生长，FTIR和XPS光谱证实了氮基团在功能化表面的存在衍生化技术还表明，用于胺化的血浆条件是有效的，血浆选择性良好，最初接枝的氮为6%，胺为3.4%此外，等离子体处理导致衬底润湿性增加，主要是由表面功能化引起的AFM图像显示，表面形貌和粗糙度没有变化，没有发现表面蚀刻的证据，小鼠NIH-3T3成纤维细胞和人内皮细胞EAhy，926个用于评价细胞对PVA底物的亲和力与天然PVA相反，等离子体修饰的表面允许两种细胞类型的细胞附着和生存，该方法在水凝胶作为组织工程支架的应用方面具有广阔的前景这项工作的下一步是进一步将这种表面修饰转移到上述圆柱形管中，以便进行体内试验«——【·参考文献·】——»
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