编译：微科盟草重木雪，编辑：微科盟Emma、江舜尧
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本文来源《蛋白质组》公众号
导读乳腺在从青春期到妊娠期、泌乳期和退化期过程中会发生显著的生理变化
然而，在小鼠乳腺发育过程中，蛋白质在调节这些过程中的动态作用尚未得到彻底探索
在本研究中，我们收集了8-10周成熟青春期（V）、妊娠第16天（P16d）、哺乳第12天（L12d）、强制断奶第1天（FW1d）和强制断奶第3天（FW3d）阶段的小鼠乳腺组织，使用基于DIA的定量蛋白质组学技术进行分析
共鉴定了3312种蛋白质，其中843种是DAPs，根据其在发育阶段的丰度变化将其分为9个簇
第2组中的DAP在L12d期达到峰值，主要与乳腺发育和泌乳有关
蛋白质-蛋白质相互作用网络显示，表皮生长因子（EGF）是该簇的核心
我们的研究全面概述了小鼠乳腺发育蛋白质组，并确定了一些重要的蛋白质，如EGF、Janus激酶1（JAK1）和信号转导子和转录激活子6（STAT6），这些蛋白质可能是未来研究的潜在靶点，为深入了解乳腺发育生物学提供指导
图文摘要论文ID原名：Protein Dynamic Landscape during Mouse Mammary Gland Development from Virgin to Pregnant, Lactating, and Involuting Stages译名：小鼠乳腺从青春期到妊娠期、泌乳期和退化期发育过程中的蛋白质动态景观期刊：Journal of Agricultural and Food ChemistryIF：6.1发表时间：2024.3通讯作者：李紫聪、吴珍芳、郑恩琴通讯作者单位：华南农业大学实验设计结果1. 定量蛋白质组学分析本研究共鉴定出3312种蛋白质
具体而言，在V期检测到2939种蛋白质，在P16d期检测到3153种，在L12d期检测到3018种，在FW 1d期检测到293种，在FW 3d期检测到3070种（图1A，支持信息表S1）
主成分分析（PCA）显示，来自五个不同阶段的样品表现出明显的分离，来自同一阶段的样品可以很好地聚集在一起（图1B）
此外，五个阶段蛋白质的无监督分层聚类和热图（图1C）强调了每个阶段样本之间的强大相关性，证实了我们蛋白质组学数据集的可靠性
图1 小鼠乳腺发育过程中蛋白质组的全信息
（A）在小鼠乳腺组织的V、P16d、L12d、FW 1d和FW 3d阶段鉴定的蛋白质数量
（B）总鉴定蛋白质的主成分分析
相同的颜色代表同一阶段的生物复制，位于每个圆圈中心的点代表每组的平均蛋白质丰度
（C）从15个小鼠乳腺样本中鉴定的蛋白质的无监督分层聚类和热图
2. 乳腺发育过程中鉴定的阶段特异性蛋白质的属性在至少一个阶段中检测到3312种蛋白质，在所有阶段中鉴定出2673种蛋白质
此外，16、72、13、5和23种蛋白质分别仅在V、P16d、L12d、FW 1d和FW 3d阶段被发现（图2A，支持信息，表S2）
随后，通过GO分析对这些阶段特异性蛋白质进行注释
具体而言，V期独有的蛋白质在ERK1和ERK2级联（GO:00070372）以及ERK1和ERK2级联（GO：0070371）的调节中表现出富集
P16d阶段的特异性蛋白质富集在DNA复制（GO:0006260）和核糖核蛋白复合物生物发生（GO:0022613）
L12d阶段的独有的蛋白质富集在对mRNA加工的调节（GO:00050684）、对细胞分泌的负调节（GO:1903531）和对分泌的负调控（GO:0051048）
FW 1d阶段的独有的蛋白质富集在蛋白质磷酸化的负调控（GO:00001933）和磷酸化的负调控（GO:0042326）
最后，FW 3d阶段的独有蛋白质在组织重塑的调节中富集（GO:003103）（图2B）
图2 阶段特异性蛋白质的功能分析
（A）在每个阶段在小鼠乳腺中鉴定的蛋白质重叠
（B）阶段特异性蛋白质的功能分析
圆圈的大小表示GO术语中富集的蛋白质与该GO术语中所有蛋白质的比率，红色表示更显著的富集
3. 在小鼠乳腺发育过程中DAP的鉴定在本研究中，共有843种蛋白质表现出显著的差异丰度（FDR<0.05，|log2（倍数变化）|≥1，表S3）
在实验条件下的成对比较中，P16d_V、L12d_P16d、FW 1d_L12d和FW 3d_FW 1d的比较发现，随着乳腺发育，蛋白质丰度最初增加，然后减少，然后再次增加
此外，与V期相比，大多数蛋白质在P16d、L12d、FW1d和FW3d期表现出增加的丰度
与P16d期相比，L12d、FW 1d和FW 3d期的更多蛋白质的丰度逐渐降低
在L12d_V组中观察到蛋白质组最显著的变化，而在FW 1d_L12d组中发现最少的蛋白质组变化
这些变化可能与乳腺发育过程中MECs的增殖、分支形态发生、肺泡形成和组织重塑有关（图3A）
然而，在FW 1d和L12d阶段（FW 1d_L12d组）之间识别的所有DAP的log2（倍数变化）值均大于10
这表明，从L12d到FW1d阶段，这两个阶段之间的DAP丰度有很大变化（图3B）
图3 DAPs在小鼠乳腺发育过程中的全信息
（A）在五个小鼠乳腺发育阶段的顺序配对比较中，DAPs的丰度增加和减少
（B）根据成对比较绘制的丰度的Log2变换
仅显示通过应用阈值的蛋白质（|log2（倍数变化）|≥1，FDR<0.05）
4. 小鼠乳腺发育过程中DAP的聚类分析为了探索所有DAP在五个连续发育阶段丰度的动态变化，我们使用Mfuzz R软件包进行了时间序列聚类分析
该分析将所有DAP划分为九个不同的簇，每个簇都具有独特的表达模式（图4A，表S4）
在9个聚类中，聚类2、4、8和9中的DAP在L12d阶段表现出峰值丰度水平
每个聚类的特异性蛋白质计数如图4B所示
基于GO分析，每个聚类显示出与生物过程、分子功能和细胞成分相关的不同特征
例如，与高尔基体小泡运输相关的GO术语在簇4中富集，而与核糖核蛋白复合物生物发生相关的术语在簇8中富集
簇9表现出与核糖体合成相关的GO术语的富集
重要的是，与乳腺发育和泌乳有关的GO术语在簇2中富集（图4C）
图4 DAPs在小鼠乳腺发育过程中的动力学
（A）模糊c-均值聚类确定了九种不同的蛋白质表达时间模式
x轴表示五个发育阶段，而y轴表示log2变换，即每个阶段的归一化强度比
（B）饼图显示了每个簇中蛋白质的数量
（C）蛋白质簇的功能分析
圆圈的大小表示在GO项中富集的DAP与该GO项中所有蛋白质的比率，红色表示更显著的富集
5. 簇2中DAP的PPI网络分析簇2中显著富集了乳蛋白，如κ酪蛋白（CSN3）、α-S1-酪蛋白（CSN1S1）、α-S2-酪蛋白样B（CSN1S2B）和乳清酸性蛋白（WAP），这表明该簇中的蛋白质与乳合成和分泌过程可能存在关联
此外，从系统的角度理解乳腺发育的分子机制有助于蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）分析
为了揭示簇2的差异丰富蛋白质中的蛋白质调控网络，我们通过使用STRING数据库进行PPI网络分析，并通过Cytoscape软件进行可视化
在簇2中，83种蛋白质中，31种显示出相互连接，一些乳蛋白显示出高度连接
EGF作为簇2中的主要枢纽蛋白出现，显示出最高数量的连接
它表现出与乳蛋白的密切联系，同时也表现出与JAK1和STAT6蛋白的牢固联系
JAK/STAT信号通路在乳腺发育和泌乳过程中发挥重要作用（图5）
图5 簇2中DAPs的PPI网络6. 免疫荧光分析小鼠乳腺发育过程中EGF蛋白的动态丰度对EGF蛋白丰度的分析揭示了乳腺发育不同阶段的显著差异
如免疫荧光分析所示，在泌乳开始时观察到EGF的显著上调，与乳腺发育早期检测到的最低水平形成鲜明对比
这些结果显示出与DIA分析结果一致的EGF丰度模式，增强了DIA技术的可靠性（图S1）
此外，在小鼠乳腺中，管腔上皮细胞已被证明表达细胞角蛋白18（CK18）
腔细胞中检测到EGF的蛋白质丰度（图6）
图6 乳腺发育过程中EGF蛋白的免疫荧光染色
腔细胞由没有尾部的箭头表示
EGF（红色）、CK18（绿色）、DAPI（蓝色）
比例尺，20μm
讨论我们成功地获得了代表小鼠乳腺发育五个阶段的蛋白质组，共鉴定了3312种不同的蛋白质
我们的研究表明，鉴定的蛋白质数量在不同阶段没有显著变化
在整个乳腺发育过程中，总蛋白质计数保持相对稳定，88.7%的已鉴定蛋白质已存在于早期发育阶段（V期）
仅3.9%的鉴定蛋白是V、P16、L12、FW 1d和FW 3d期所特有的，共有129个相应的蛋白
这一发现突显了一组核心蛋白质在整个乳腺发育过程中的持久性，而一组阶段特异性蛋白质在特定发育阶段发挥着至关重要的作用
我们的功能分析阐明了这些阶段特异性蛋白质在驱动特定生物过程中的重要性
V期的独特蛋白富含与ERK1和ERK2级联相关的GO术语，已知其调节基本的生物功能，包括细胞增殖和存活
在青春期小鼠的腺体中，导管的复杂性通过上皮细胞的增殖和每个发情周期中侧枝的增加而增加
此外，在L12d阶段也观察到这些富集的GO项，已知其调节乳蛋白合成
在P16d阶段，独特蛋白与DNA复制和核糖核蛋白复合物生物发生相关的GO术语相关，而在L12d阶段的独特蛋白与细胞分泌过程相关
在妊娠中期左右，随着腺体进入分泌起始阶段，细胞分化成为主导
肺泡芽逐渐分裂并分化为单个肺泡，最终在哺乳期成为分泌乳汁的小叶
在哺乳期，乳汁合成和参与蛋白质合成的基因的显著增加促进了肺泡细胞的分泌激活
乳汁大量分泌到肺泡腔中
然后，乳汁通过肌上皮细胞的收缩排出，并通过含乳管输送到乳头
类似地，FW 1d阶段的独特蛋白质富集在与蛋白质磷酸化相关的GO术语，FW 3d阶段的独特蛋白与组织重塑过程有关
退化过程分为两个阶段，其特征是基因表达模式、生化反应和组织学特征的变化
第一阶段的特点是乳汁淤积，没有主要的形态学变化
该阶段的主要凋亡途径是溶酶体介导的细胞死亡（LCD）途径
STAT3是Stat蛋白家族的一员，在退化过程中起着关键作用，在退化的初始阶段被磷酸化为其活性形式
第二个不可逆阶段发生在断奶48小时后，其特征是线粒体介导的内在凋亡途径占主导地位，促进乳腺重塑
我们发现与细胞分泌过程相关的GO术语在FW 1d和FW 3d阶段都富集
STAT3被分泌的细胞因子激活，如白血病抑制因子（LIF）、白细胞介素-6（IL6）和转化生长因子（TGF）β3，以应对乳汁淤积
此外，细胞外基质（ECM）分泌的生长和分化因子有助于退化第二阶段的脂肪生成
因此，这些发现与已知的乳腺发育的生物学过程一致
尽管乳腺发生动态发育变化，但MECs的原发性增殖主要发生在妊娠期
在P16d阶段，我们鉴定了数量最多的阶段特异性蛋白，共有72种特异性蛋白
值得注意的是，该组包括WDR55、MCM6、MCM7和DHFR等蛋白质，它们是参与细胞增殖过程的高丰度蛋白质
这项研究与Davies等人的发现一致，其中微小染色体维持蛋白3（MCM3）的蛋白质在妊娠和退化期间增加，随后在哺乳期间减少
在我们的乳腺蛋白质组结果中，共鉴定出843种差异丰富的蛋白质
在对不同发育阶段的蛋白质水平进行成对比较后，出现了一个有趣的现象，随着乳腺发育的进展，蛋白质丰度先增加，然后减少，最后再次增加
这种动态变化可归因于驱动乳腺组织转化的几个关键因素：MECs的增殖、导管分支、管腔上皮细胞的快速扩张以及妊娠期间肺泡的形成
随后，在哺乳期，主要关注的是维持乳腺乳汁分泌
断奶后，乳房上皮中的乳汁停滞，开始退化过程
在FW 1d期，最初的退化过程是可逆的，恢复哺乳重建了乳汁供应
随着乳腺退化的进展，差异丰富的蛋白质数量逐渐增加，特别是在第二个不可逆期的FW 3d阶段
这可归因于蛋白酶的显著上调，包括明胶酶a和基质溶素-1等基质金属蛋白酶，它们在这一阶段调节乳腺重塑和细胞凋亡
在这五个时期中，在L12d_V组中观察到最高数量的差异丰富的蛋白质
值得注意的是，B4GALT1是该组中已鉴定的蛋白质之一，作为影响牛奶性能性状的候选基因具有重要意义，并编码乳糖合成的催化成分
在FW 1d_L12d组中观察到最小数量的差异丰富的蛋白质
在该组鉴定的蛋白质中，STEAP4，一种下调的蛋白质，已被报道在调节脂肪生成中发挥作用
然而，基质脂肪细胞在哺乳期会显著减少
随后的断奶期触发乳腺退化，导致肺泡细胞消退，脂肪细胞迅速膨胀，重新填充基质组织
本研究中鉴定的所有差异丰富的蛋白质被分为九个不同的簇，表明它们在调节乳腺发育中的不同作用
通过GO富集分析进一步验证了这种多样性
特别值得注意的是，只有簇2中的蛋白质在与乳腺发育和泌乳相关的途径中富集
WAP、CSN1S1、CSN1S2B和CSN3的这些乳蛋白在簇2中富集
此外，EGF在簇2中高度富集，显著促进肺泡发育和乳蛋白表达
簇2中的蛋白质不仅在L12d阶段达到其峰值丰度，而且簇4和8中的蛋白质在该阶段也表现出峰值表达
哺乳过程是哺乳动物的一个独特生理特征，需要在分娩前形成肺泡和分化肺泡，以合成和分泌乳汁成分
具体而言，簇4中的蛋白质主要与蛋白质转运功能相关
含跨膜emp24结构域（TMED）蛋白家族已成为关键的蛋白质转运调控因子
第4簇中的TMED3可以识别内质网关键糖基化膜蛋白货物，并将其引导到细胞表面
同时，簇8中的蛋白质主要与核糖体形成有关，核糖体是蛋白质合成的位点
mTOR是细胞蛋白质合成的关键调节因子
一旦被激活，mTOR复合物1（mTORC1）被磷酸化，并激活核糖体蛋白S6激酶1（S6K1）以磷酸化簇8中的核糖体蛋白S6（RPS6），从而调节乳蛋白合成
这些发现与哺乳期乳汁蛋白质合成和分泌的增加一致
在分泌激活过程中，肺泡细胞内内质网和高尔基体的含量增加
此外，一项针对小鼠的研究表明，在分泌激活过程中，促进乳汁合成的基因表达增加
我们构建了一个蛋白质-蛋白质相互作用网络，以进一步研究乳腺发育和泌乳的调控
EGF表现出与乳蛋白和PPI网络内簇2中的大多数蛋白的相互作用
牛奶蛋白是牛奶的重要成分
乳蛋白通常分为两类：乳清蛋白和酪蛋白，它们被认为是乳腺分泌分化的标志物
CSN1S1占牛奶中酪蛋白的大部分，而CSN3在维持酪蛋白胶束的结构和稳定性方面发挥着至关重要的作用，并影响牛奶的凝固和奶酪质量
因此，我们选择EGF进行后续分析
已观察到Mcl-1蛋白在转换到哺乳期时在肺泡细胞中上调，其缺乏已被证明会损害哺乳
此外，EGF被认为是乳糖生成中最高度上调的基因之一
抑制EGF显著阻碍泌乳，同时Mcl-1减少
EGF是Mcl-1翻译的关键触发因子，可确保哺乳期肺泡细胞的存活
在这项研究中，我们通过免疫荧光分析证实了L12d阶段EGF蛋白丰度的增加，这与先前研究的结果一致
此外，这进一步表明EGF似乎主要在哺乳期开始时被诱导
作为JAK家族的成员，JAK1表现出广泛的表达特征
JAK1的缺失会导致胚胎或新生儿死亡
JAK1在细胞因子诱导的乳腺上皮细胞中STAT1、STAT3和STAT6的酪氨酸磷酸化中起着关键作用
JAK1主要在泌乳期乳腺STAT蛋白的激活到退化转换中发挥离散作用，这有助于泌乳后退化期上皮室的重塑
此外，STAT6还通过调节免疫反应参与肺泡细胞发育的调节
STAT6是维持乳腺谱系平衡的重要调节因子
先前的一项研究表明，Jak1和Stat6基因都在管腔上皮细胞中表达
因此，EGF、Jak1和Stat6蛋白之间可能存在相互作用，共同调节乳腺发育