一、实验器材及试剂1、 实验器材多样品研磨珠均质仪台式高速冷冻型微量离心机荧光定量PCR仪超净工作台分光光度计离心管TIP头2、 主要实验试剂及耗材RNA提取液三氯甲烷异丙醇无水乙醇HyPure TMMolecular Biology Grade WaterRevertAid First Strand cDNA Synthesis KitFastStart Universal SYBR Green Master(Rox)引物75%乙醇：HyPure TMMolecular Biology Grade Water配制离心管、TIP头均购湿热灭菌40min，干燥
二、荧光定量PCR实验步骤1、总RNA抽提（枪头和离心管均经过湿热灭菌，无RNA酶）1）取匀浆器，加入1ml的Trizol Reagent，置冰上预冷
2）取100mg组织，加入到匀浆器中
3）充分研磨直至无可见组织块
4）12000rpm离心10min取上清
5）加入250 μl三氯甲烷，颠倒离心管15s，充分混匀，静置3min
6）4℃ 下12000rpm离心10min
7）将上清转移到一新的离心管中，加入0.8倍体积的异丙醇，颠倒混匀
8）-20℃ 放置15min
9）4℃下12000rpm离心10min，管底的白色沉淀即为RNA
10）吸除液体，加入75%乙醇1.5ml洗涤沉淀
11）4℃下12000rpm离心5min
12）将液体吸除干净，将离心管置于超净台上吹3min
13）加入15μl无RNA酶的水溶解RNA
14）55℃ 孵育5min
15)使用UV1800检测RNA浓度及纯度：仪器空白调零后取2.5μl 待测RNA溶液于检测基座上，放下样品臂，使用电脑上的软件开始吸光值检测
16）将浓度过高的RNA进行适当比例的稀释，使其终浓度为200ng/μl.左右
2、反转录（枪头和PCR均经过湿热灭菌，无RNA酶）1）取一PCR管，加入含2μg RNA的溶液
2）加入1μl 逆转录引物
3）用无核糖核酸酶的去离子水补足至12μl
4）于PCR仪上65℃ 保温5min，迅速置冰上冷却
5）依次加入4μl 5×buffer，2μl 10mM dNTPs，1μl RNA inhibitor和1μl 反转录酶，用枪抽吸混匀
6）于PCR仪上42℃保温60min，结束后80℃保温5min灭活反转录酶
3、定量PCR1）取0.2ml PCR管，配制如下反应体系，每个反转录产物配制3管
2× qPCR Mix12.5μl7.5μM基因引物2.0μl反转录产物2.5μlddH2O8.0μl2）PCR扩增预变性95℃，10min循环（40次） 95℃，15s→60℃，60s熔解曲线75℃→95℃，每20s升温1℃4、结果处理ΔΔCT法：A=CT(目的基因，待测样本)- CT(内标基因，待测样本)B=CT(目的基因，对照样本)- CT(内标基因，对照样本)K=A-B表达倍数=2-K