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CHIRP实验详细方法流程一、细胞收集(对于单层细胞或贴壁细胞)1.准备细胞5E7细胞2.用10 mL冰冷的PBS洗涤培养瓶或平板上的细胞两次3.加入10 mL冰冷的PBS从每个培养瓶或平板上刮下细胞，然后转移到离心管4.通过在4°C下以1500 rpm离心5 min来收集细胞，并丢弃上清液细胞沉淀-80℃保存二、细胞裂解1.解冻细胞颗粒2.通过在4°C下以2000 g离心3 min将细胞制成颗粒3.去除残留的PBS4.称量每个颗粒5.制备完全裂解缓冲液每个100 mg细胞颗粒添加5 µL 200X蛋白酶抑制剂和5 µL RNase抑制剂到1.0 mL裂解缓冲液中搅拌均匀6.将每100 mg细胞沉淀重新悬浮在1.0 mL完全裂解缓冲液中，超声裂解7.4℃12000 g离心10 min，取上清到新的1.5 ml EP中，并在-80°C下保存，或继续进行免疫沉淀三、 ChIRP免疫沉淀1.取细胞裂解上清液100 µl至1.5 mlEP管，-20℃保存，此为Input2.准备完全的杂交缓冲液杂交缓冲液至37°C，以分解任何沉淀加入300 µL甲酰胺到1.7 mL杂交缓冲液，然后加入10 µL 200X蛋白酶抑制剂和10 µL RNase抑制剂3.将1 mL细胞裂解液转移到每个15 mL锥形管中，在每根试管中加入2 mL完全杂交缓冲液，混合均匀4.每根管中加入100 pmol探针（2 µL 50 µM探针），混合均匀在37°C下旋转孵育4小时5.4小时后，从步骤5中加入100 µL链霉亲和素磁珠悬液，37°C下旋转孵育30 min6.重复清洗磁珠5-6次，每次在37℃旋转洗5 min7.清洗好的磁珠每个IP组取1/5磁珠于新EP管中用于提取RNA，剩下的4/5用于提取蛋白input组取20 μl提取RNA，剩余80 μl提取蛋白四、RNA和蛋白的洗脱RNA洗脱：向磁珠中加入50 μl Proteinase k buffer和10 μl Proteinase K，于65℃孵育1 h，然后95℃孵育10 min，迅速置于冰上2 min，加入TRIZOL提取RNAinput组直接加入TRIZOL提取RNARNA产物逆转成cDNA然后进行qRT-PCR检测蛋白洗脱：向磁珠中加入40 μl elution buffer，2 μl DNase I 、2 μL RNase A和1 μL RNase H，于37℃孵育30 min，后加入10 μl 5x蛋白Loading buffer，100℃煮10 min后离心取上清于新的EP管中即为蛋白产物蛋白产物可用于银染，质谱或WB检测五、将RNA反转录成cDNA标记适当数量的0.2 mL PCR管，以供分析的样本数量，并放在冰上将9 μL（最多2 μg）的RNA加入PCR管中，放在冰上在每个PCR反应管的在冰上加入适量的试剂，如表所示4.将PCR反应管置于热循环器中5.启动以下RT反应程序：37℃,1 h; 95℃, 5 min, 4℃保存6.取下PCR管用180 μL无核酸酶水（稀释10倍）稀释产物产物可以存储在-20°C六、 qPCR检测在qPCR管中配制如下混合液2.按下列条件进行qPCR反应七、蛋白银染固定：电泳结束后，取凝胶放入约100 ml固定液中，在摇床上室温摇动20 min，摇动速度为60-70 rpm固定40min以上甚至过夜可以进一步降低背景30%乙醇洗涤：弃固定液，加入100 ml 30%乙醇，在摇床上室温摇动10 min，摇动速度为60-70 rpm水洗涤：弃30%乙醇，加入200 ml Milli-Q级纯水或双蒸水，在摇床上室温摇动10 min，摇动速度为60-70 rpm如果本步骤用水洗涤更长时间，对降低染色的背景略有帮助增敏：弃水，加入100 ml银染增敏液(1X)，在摇床上室温摇动2 min，摇动速度为60-70 rpm水洗涤(共2次)：弃原有溶液，加入200 ml Milli-Q级纯水或双蒸水，在摇床上室温摇动1 min，摇动速度为60-70 rpm弃水，再加入200 ml Milli-Q级纯水或双蒸水，在摇床上室温摇动1 min，摇动速度为60-70 rpm银染：弃水，加入100 ml银溶液(1X)，在摇床上室温摇动10 min，摇动速度为60-70 rpm水洗涤：弃原有溶液，加入100 ml Milli-Q级纯水或双蒸水，在摇床上室温摇动1-1.5 min，摇动速度为60-70 rpm注意：水洗涤的时间不能超过1.5 min显色：弃水，加入100 ml银染显色液，在摇床上室温摇动3-10 min，直至出现比较理想的预期蛋白条带，摇动速度为60-70 rpm终止：弃银染显色液，加入100 ml银染终止液(1X)，在摇床上室温摇动10 min，摇动速度为60-70 rpm水洗涤：弃银染终止液，加入100 ml Milli-Q级纯水或双蒸水，在摇床上室温摇动2-5 min，摇动速度为60-70 rpm保存：可在Milli-Q级纯水或双蒸水中保存或采用适当的方式制备成干胶八、ChIRP实验结果8.1 qPCR检测结果（质控1）例如：结果说明：目的RNA探针能够有效的富集其靶标RNA8.2银染结果（质控2）例如：结果说明：银染结果显示目的探针组有差异蛋白拉出，可进行后续的质谱分析8.3 质谱结果质谱结果见附件8.4 ChIRP-WB结果例如：结果说明：通过ChIRP-WB验证circCCDC134和蛋白ALKBH5、YTHDF2互作本次实验的目的是使用ChIRP-MS或者ChIRP-WB的方法，通过设计目的RNA互补配对的DNA探针，在目的细胞中通过目的探针把相应的DNA-RNA-蛋白复合物沉淀下来，经过分离纯化并对结合在复合物上的蛋白进行MS或WB分析，寻找目的RNA的靶标蛋白，或在不同遗传背景或处理条件下的互作变化广州基云生物拥有资深的项目管理专家和经验丰富的技术团队，提供专业的研究方案、严格项目质控、科学的数据分析，为互作机制提供专业建议，助力快速获取互作机制分子，突破互作机制研究瓶颈难题参考文献：ALKBH5-mediated m6A modification of circCCDC134 facilitates cervical cancer metastasis by enhancing HIF1A transcription. Journal of experimental & clinical cancer research. 2022.
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