«——【 ·前言· 】——»生物体内的代谢途径是维持生命活动的基础，通过一系列酶催化反应，将底物转化为产物，从而支持细胞的生长、繁殖和适应环境的能力
塞雷纳单色漆酶作为一类重要的酶，在多种生物体内发挥关键作用，参与了各种代谢途径的调控和实施
其多样的底物特异性和广泛的功能性质使其成为生命科学和应用研究领域的热点之一
塞雷纳单色漆酶被发现在许多生物体中，包括细菌、真菌、植物和动物
在代谢途径中，塞雷纳单色漆酶通常作为催化酶，参与有机化合物的氧化反应，将底物转化为氧化产物
这些反应不仅在维持细胞内能量平衡中起着关键作用，还可能影响细胞的应激响应、抗氧化防御以及次生代谢产物的合成等重要生物学过程
通过结合生物化学、分子生物学、代谢组学等多种方法，我们将揭示塞雷纳单色漆酶在不同代谢途径中的实际作用性，以及其在生命过程中的功能和调控机制
我们期望本研究能够为生命科学研究提供新的视角，同时也为生物工程和药物开发等领域的应用提供有益的信息和启示
«——【 ·生长条件· 】——»Cerrena unicolor的菌株FCL139是从雷根斯堡大学的培养物收集中获得的，并保持在2%（w / v）麦芽琼脂倾斜上
每个锥形烧瓶使用直径为0.5cm的琼脂菌丝片接种林登伯格和霍尔姆培养基[25]，并将培养物在7°C下在非搅拌条件下生长28天
收集菌丝体垫并在分散器中匀浆，菌丝体悬浮液匀浆（2.5% v / v）用作所有研究的接种物
将真菌在轨道旋转摇床中以200rpm的速度在8°C下在含有28mL林德伯格和霍尔姆培养基的100mL锥形瓶中生长40天
每个培养变体一式三份进行
被测化合物的所有储备溶液均在水中制备（CdCl2， 氯化锰2和铜4）或在乙醇（藜芦酸和阿魏酸）中，并通过Sterivex-GS过滤器
在生长的第2天将单独的溶液添加到真菌培养物中，并在接下来的1天继续生长
培养基中的最终浓度为维酸和阿魏酸的0.10 mM，CdCl的最终浓度为<> μM2， 氯化锰2和铜4.生长培养基中乙醇的最终浓度始终小于0.5%，并加入等量的乙醇以控制不含芳香酸的培养物
在生长的第4天也评估了低温和高温的影响，并在进行分析之前将培养物置于40或2°C下26小时[6000]
使用Miracloth收集培养滤液并离心（4×g，20°C）15分钟以除去菌丝碎片
所得液体用于蛋白质组学和其他分析
«——【 ·漆酶活性· 】——»使用Infinite 200 Pro酶标仪（Tecan，Männedorf，瑞士）在三个单独的生物复制中以25μM丁香醛达嗪（4-羟基，3，5-二甲氧基苯甲醛）（美国密苏里州圣路易斯奥尔德里奇）为底物，悬浮在0.1 mM，柠檬酸盐磷酸缓冲液pH 5.3中，一式三份测量漆酶活性
在525°C下记录在20nm处氧化产物的形成
漆酶活性表示为nkat/L.使用考马斯亮蓝G-250染料结合法测定蛋白质浓度，动力学参数和消化漆酶的电化学实验如前所述
«——【 ·分离蛋白质样品· 】——»为了分离和可视化培养物天然中的漆酶同工酶，使用了10%的PAGE
电泳在4°C和145V下进行
每个凝胶泳道上样10 μg等分试样的单个蛋白质样品
在0°C下，用01.0%愈创木酚在1.5M柠檬酸盐磷酸盐缓冲液（pH 3.20）中观察漆酶活性
同时，按照Laemmli的描述进行10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）[29]
分离后，通过银[30]或考马斯亮蓝G-250染色观察蛋白质
预染色蛋白质分子量标准用作分子量标记
G：Box（Syngene，Frederick，MD，USA）凝胶成像系统用于凝胶成像
通过 LC-MS/MS 进行肽测序«——【 ·前言· 】——»生长8天后进行分泌组分析
使用Vivaspin 10（德国达姆施塔特密理博）的3 kDa超滤膜将培养滤液浓缩20次，然后在测量蛋白质浓度后，在FreeZone 100冷冻干燥机（美国密苏里州堪萨斯城Labconco）中冻干含有12ug蛋白质的体积
将含有100μg蛋白质的单个干燥样品悬浮在100μL的100mM碳酸氢铵中，并在5°C下用2mM tris[1-羧乙基]膦-HCl（TCEP）还原60小时，用10mM甲基甲烷磺酸盐（MMTS）封闭10分钟，并用10ng / uL质谱级胰蛋白酶消化过夜
使用UPLC结合Orbitrap Velos质谱仪分析所得肽混合物
使用本地MASCOT服务器将母离子和子离子的输出列表与单色C.的蛋白质数据库进行比较
«——【 ·LC-MS/MS 分析· 】——»采用LC-MS/MS分析单色梭菌胞外蛋白，基于独特肽的存在，鉴定出5种漆酶同工酶和1种天冬氨酸蛋白酶（表1).鉴定出的漆酶具有相似的分子量，但在pI上有所不同，其pH范围为4.44至5.92
所有已鉴定的漆酶的计算分子量约为55 kDa，除了一种（蛋白质ID 418196），其质量似乎相当低（23 kDa），就像真菌漆酶一样
虽然，对编码这种蛋白质（C. unicolor 303基因组）的基因的详细分析揭示了未鉴定核苷酸的重复序列，这表明这种漆酶的分子量高于最初预测的
«——【 ·漆酶基因的分析· 】——»将单色梭菌培养滤液中LC-MS/MS检测到的漆酶蛋白的产生与qPCR分析进行比较，qPCR分析采用一组针对相关mRNA转录物的特异性引物（表S1）
在含有芳香酸（阿魏酸或阿魏酸）、金属离子（镉、锰或铜）的培养物中或在4和40°C孵育后测量单个基因的转录水平
使用经典方法，包括配对实验设计（治疗与对照）下的δ-δCt方法
只有一个编码蛋白质364416的基因被发现被所有三种金属离子上调（5倍）
编码漆酶、408157和418196的基因转录由铜和/或锰离子轻微诱导
温度以不太特异性的方式影响漆酶基因转录（图1b）. 编码漆酶的4个基因的转录在40 °C下调，在390880 °C下调
然而，当真菌在两种温度下生长时，只有漆酶193382的转录本被抑制
上调408157基因的转录，而藜芦酸仅刺激<>漆酶编码基因（图1综上所述，芳香酸略微下调了大多数漆酶编码基因的转录
编码418196基因蛋白质的基因受影响最小，而364416和40157基因的表达受研究因素影响最大
«—【 ·漆酶酶电泳曲线· 】—»qPCR分析显示24小时后漆酶基因表达的一些小变化，因此，我们还测定了诱导后48小时漆酶活性
所有测试的变体在真菌培养物中48小时后导致漆酶活性更高（图2).结果表明，添加锰或藜芦酸在48 h后刺激漆酶活性，分别比对照组高9倍和7倍
与40 °C相比，在4°C孵育单色梭菌培养物后，仅观察到漆酶活性略有增加
在可视化的电泳图中，在4°C培养孵育并加入镉离子以及存在阿魏酸或藜芦酸（图3a），表明这些化合物影响了单个漆酶转录本
当使用SDS-PAGE（图3b）. 在培养变体中，4°C和藜芦酸观察到较低量的蛋白质条带（表示为Lac5），而将锰添加到单色C.培养物中，对应于Lac3的条带强度较低
此外，假定的Lac2带在4°C时的强度表明其过度生产
在其他培养变体中，可以观察到蛋白质量的细微差异，表明测试的化合物最有可能影响单个漆酶的翻译水平
«——【 ·二维电泳· 】——»使用8D-PAGE浓缩和分析来自未诱导的2天龄单色梭菌培养物的细胞外蛋白
大多数蛋白质集中在 3–6 的 pH 范围内，分子量范围为 15 至 130 kDa（图4).切割对愈创木酚具有活性的蛋白点并提交LC-MS/MS测序
基于现有单色梭菌基因组中对应于基因序列的独特肽的存在，鉴定了与之前在培养液中鉴定的相同的五种漆酶同工酶（表S2）
观察到九个不同的斑点（L1-L9）具有漆酶活性，每个斑点由几种漆酶蛋白组成
尽管预测分子量范围为35至55 kDa，但观察到漆酶蛋白斑点在35至70 kDa之间
计算出的漆酶理论pI值范围为4.3至5.9，而实验pI值范围为3.5至4.0
应该注意的是，对培养液中的总蛋白进行的分泌组学分析和对来自2D凝胶的蛋白质斑点进行的LC-MS / MS分析都表明存在具有假定漆酶特性的23 kDa蛋白
然而，对编码该漆酶的基因进行了额外的重测序，结果证明我们的菌株（C. unicolor FCL139）基因组包含完整的漆酶序列，而不是像之前报道的那样，该物种的核苷酸序列不明确
因此，该斑点的蛋白质组学结果应表明蛋白质为MW 55 kDa而不是23 kDa
«——【 ·蛋白水解修饰· 】——»前面描述的蛋白酶分离步骤允许用天冬氨酸样蛋白酶从单色梭菌培养物中分离细胞外蛋白
分离的蛋白酶对胃抑素表现出高敏感性（85.7%的抑制），结合我们的LCMS / MS数据表明它是天冬氨酸样蛋白酶
当与纯化的蛋白酶混合时，纯化的漆酶样品在孵育146分钟后显示出活性增加至60%
孵育的延长时间略微升高至155%
K型m孵育0分钟后，消化的漆酶在时间上从54.0减少到16.120mM（表2).在V中观察到类似的现象.max其值从 64.43 下降到 37.85 μM/min
«——【 ·结论· 】——»通过本研究，我们对塞雷纳单色漆酶在代谢途径中的作用和实用性进行了深入的探究，为我们理解细胞的代谢调控机制提供了新的见解
通过多种研究方法的综合应用，我们揭示了塞雷纳单色漆酶在多种代谢途径中的底物选择、催化机制以及与其他代谢酶的相互作用
这些发现不仅增强了我们对塞雷纳单色漆酶的认识，还为其在生命科学和应用研究中的潜在价值提供了新的启示
尽管我们在这项研究中取得了一些重要的进展，但仍然有许多未知的领域需要进一步探索
塞雷纳单色漆酶作为一个多功能酶，其底物选择和调控机制可能因生物体的种类和环境条件而异
未来的研究可以深化我们对其功能多样性的理解，探索其在不同生物体和生态环境中的作用
总之，本研究为我们揭示了塞雷纳单色漆酶在代谢途径中的重要作用和实用价值，为生命科学和应用研究领域提供了新的研究方向
我们期望这些发现能够为生物学领域的发展和创新提供有益的贡献，同时也为解决现实生活中的问题提供新的思路和策略
希望我们的努力能够为科学界和应用领域带来新的突破，推动科学的进步和发展