阅读文章前，辛苦您点下右上角的“关注”，方便您讨论分享，持续关注每日优质内容~肠道是动物重要的消化吸收器官，担当着维持机体健康生长及发育的重要使命，在此过程中，肠道微生物发挥着重要作用
动物肠道中生存有大量微生物，这些微生物与宿主互利共生，通过肠上皮生理结构与功能影响其作用机制，从而帮助动物消化吸收，促进日粮中能量的利用
反刍动物采食大量粗饲料，纤维素的降解有赖于肠道菌群中的纤维素水解细菌
通常情况下，肠道微生物与宿主处于一种动态平衡状态，肠道微生态系统相对稳定，这种平衡和稳定对宿主健康产生深远影响
但动物的肠道菌群结构并不是一成不变的，宿主的年龄、地域、生理状况和饮食习惯等因素也会诱导肠道菌群产生一定差异
不同生长阶段的动物，其肠道菌群结构一定程度上反映了动物对营养物质的消化能力和机体的健康状况
鲁西黑头羊是以山东省地方品种小尾寒羊为母本、南非黑头杜泊绵羊作父本杂交选育而成的优质肉羊新品种，但有关鲁西黑头羊肠道微生物的研究则少有报道
本研究利用高通量测序技术，对鲁西黑头羊肠道微生物多样性及菌群功能进行研究，探讨不同生长阶段鲁西黑头羊肠道微生物的组成、结构及丰度的异同，为鲁西黑头羊健康养殖提供科学参考
材料与方法材料样品采集，以山东省农业科学院畜牧兽医研究所培育的肉羊新品种鲁西黑头羊为研究对象，样品均采于山东省农业科学院实验羊场（山东省聊城市东昌府区），所有羊只饲喂统一的TMR全混合日粮，2次/d，自由饮水
随机选取3月龄、6月龄、12月龄3个年龄段的健康无病的鲁西黑头羊公羊各4只，晨饲后4 h无菌条件下直肠采集新鲜粪便，分装于2 ml冷冻管，液氮速冻后带回实验室，-80℃冰箱保存待测
方法肠道细菌测定本试验中肠道细菌16S rDNA测序工作委托北京诺禾致源科技股份有限公司完成
首先，采用CTAB或SDS方法对样本的基因组DNA进行提取，利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度，再使用无菌水稀释样本至1 ng/µl
其次，以稀释的基因组DNA为模板，以细菌16S V4区引物（515F和806R）进行PCR扩增，使用2%浓度的琼脂糖凝胶对PCR产物进行检测合格后进行等量混样并回收
最后，使用Tru Seq®DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建库试剂盒进行文库构建，利用Illumina Miseq2 500高通量测序平台进行测序
数据分析测序完成后，使用FLASH(V1.2.7）对样本的reads进行拼接，使用fastp软件对拼接得到的Raw Tags进行过滤得到高质量的Clean Tags,Uchime algorithm去除其中的嵌合体序列后得到最终的有效数据（Effective Tags）
利用Uparse算法（Uparse v7.0.1001）对全部Effective Tags进行聚类，以97%的一致性（Identity）将序列聚类成为OTUs
用Mothur方法与SILVA138的SSUr RNA数据库进行物种注释与分析，使用Qiime软件（Version 1.9.1）计算Chao1,Shannon,Simpson,ace,Goodscoverage指数，使用LEf Se软件进行组间差异分析
菌群丰富度和多样性指数数据采用Excel2007整理，组间差异显著性分析使用SPSS 22.0软件，通过一般线性模型进行分析，并采用Duncan法进行多重比较，P<0.05表示差异显著
结果与分析不同月龄鲁西黑头羊肠道微生物OUT基础分析为研究不同月龄鲁西黑头羊肠道菌群的物种组成，对所有样本的Effective Tags以97%的一致性进行OTUs(Operational Taxonomic Units）聚类，共产生3021个OTUs，其中3月龄组、6月龄组、12月龄组分别有2 016个、2 247个、2 226个，3组共同拥有的OTUs为1 532个，3月龄组与6月龄组、12月龄组的单独共有OTUs分别为135和106个，而6月龄和12月龄组单独共有253个，表明不同月龄鲁西黑头羊肠道群结构具有一定的相似性，同时存在一定的特异性
平均序列长度为414 bp，所有样品测序覆盖率均在99.6%以上，表明测序深度能够准确反映肠道细菌的组成
不同月龄鲁西黑头羊肠道微生物多样性分析对不同月龄鲁西黑头羊肠道微生物α多样性指数进行分析，结果显示，菌群多样性指数Shannon指数和Simpson指数，以及菌群丰富度指数Chao1和ACE在各月龄间均无显著差异（P>0.05）
使用主成分分析PCo A分析法进行β多样性分析，结果如图2所示，6月龄和12月龄重叠，表示两组相似性程度较高，3月龄组与其他两组明显分离，说明3月龄组与6月龄和12月龄组间群落结构差异较大
不同月龄鲁西黑头羊肠道菌群结构分析对所得有效序列在不同分类水平上进行物种注释和统计，鲁西黑头羊直肠粪便中共注释到细菌界和古生菌界微生物47门、80纲、130目、200科、343属
对总丰度前10的物种在门水平、科水平和属水平进行分析
结果显示，在门水平上，厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidetes）为鲁西黑头羊肠道中存在的优势菌门，平均相对丰度分别为42.89%和30.76%；其次为变形菌门（Proteobacteria）和尤微菌门（Verrucomicrobiota），平均相对丰度分别为6.00%和4.28%，其他细菌门相对丰度均低于4%
6月龄和12月龄与3月龄组相比，拟杆菌门（Bacteroidetes）相对丰度显著升高（P<0.05），变形菌门（Proteobacteria）则出现极显著降低（P<0.01）
在科水平上，理研菌科（Rikenellaceae）和颤螺旋菌科（Oscillospiraceae）为肠道优势菌科，平均相对丰度分别为13.83%和11.78%，其次为毛螺旋菌科（Lachnospiraceae）和普雷沃氏菌科（Prevotellaceae），平均相对丰度分别为5.09%和5.35%，其他菌科相对丰度均在5%以下
在组间差异上，理研菌科（Rikenellaceae）在3月龄和6月龄时相对丰度为16.27%，到12月龄时显著下降到8.95%(P<0.05）；肠杆菌科（Enterobacteriaceae）和从毛单孢菌科（Comamonadaceae）在3月龄和6月龄时平均相对丰度分别为0.51%和0.43%，到12月龄时呈现极显著增长，相对丰度分别达到9.12%和4.58%(P<0.01）
在属水平上,Rikenellaceae＿RC9＿gut＿group、UCG-005为肠道优势菌属，平均相对丰度分别为9.37%和8.73%，其次为艾克曼氏菌属（Akkermansia）和拟杆菌属（Bacteroi des），平均相对丰度分别为4.18%和4.05%
在组间差异上，埃希氏-志贺氏菌属（Escherichia-Shigella）和丛毛单胞菌属（Comamonas）相对丰度在12月龄时较3月龄和6月龄出现极显著升高（P<0.01),Rikenel laceae＿RC9＿gut＿group在12月龄出现显著降低（P<0.05），其他菌属在各月龄间无显著差异
不同月龄鲁西黑头羊肠道菌群组间差异物分析利用LEf Se软件对不同月龄鲁西黑头羊肠道菌群差异物分析，LDA Score的筛选值为4，状图越长，表示物种差异性影响越大，进化分支图标注组间菌群具有显著差异的Biomarker
拟杆菌门（Bacteroidetes）、拟杆菌纲（Bacteroidia）、拟杆菌目（Bacteroidales）、螺旋菌门（Spirochaetota）、螺旋菌纲（Spirochaetia）、螺旋菌目（Spirochaetales）和Muribaculaceae、密螺旋体属（Treponema）在3月龄富集，另枝菌属（Alistipes）在6月龄组富集，在12月龄组未注释到显著差异物种信息
反刍动物具有特殊的消化系统，除了瘤胃，肠道也中栖息着复杂的微生物菌群，对宿主的消化代谢、营养补偿、机体发育发挥着重要作用，肠道微生物的种类、丰富度和多样性越高，动物健康状况越好
研究表明，动物在2.5岁前，随着群落多样性的逐渐变化，其肠道微生物多样性随年龄呈逐渐增加
本研究中，鲁西黑头羊肠道微生物α多样性在各月龄间无显著差异，表明6月龄之后肠道菌群趋于稳定，但β多样性分析显示，3月龄与6月龄和12月龄相比，明显分离，暗示各组间存在一定差异
菌群结构分析进一步显示，在鲁西黑头羊肠道菌群中，厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidetes）在各年龄阶段均占主导地位，与对羊的肠道微生物研究结果基本一致
与3月龄相比，6月龄和12月龄鲁西黑头羊肠道菌群中拟杆菌们相对丰度显著升高，而变形菌门相对丰度显著降低
拟杆菌门在提高动物对碳水化合物的利用过程中发挥重要作用，变形菌门包含大肠杆菌等致病菌，表明随年龄的增长，试验羊对饲粮中碳水化合物的利用率提高，对腹泻等羔羊疾病的抵抗力增强
组间差异分析显示，各月龄间菌群结构差异的类群主要由拟杆菌门（Bacteroidetes）和螺旋菌门（Spirochaetota）及其包含的科属相对丰度的变化所产生，且差异物种主要集中在3月龄，表明3月龄肠道菌群仍比较活跃
综上，鲁西黑头羊在3月龄之前，胃肠道仍处于快速发育阶段，肠道微生物区系具有较高的可塑性
在饲养管理过程中，可通过改善饲粮组分对其进行有效调控，以增强肠道消化吸收功能，为后期生产性能的提高奠定基础
Brestoff, J. R.,&Artis, D. Commensal bacteria at the interface of host metabolism and the immune system[J]. Nature immunology,2013, 14(7):676-684.BoulangéC L, Neves A L, Chilloux J, et al. Impact of the gut microbiota on inflammation, obesity, and metabolic disease[J].Genome medicine, 2016, 8(1):1-12.Wang J, Fan H, Han Y, et al. Characterization of the microbial communities along the gastrointestinal tract of sheep by 454pyrosequencing analysis[J]. Asian-Australasian journal of animal sciences, 2017, 30(1):100.