文 |邻村胡大爷编辑|邻村胡大爷近年来，随着水产养殖业与渔业贸易的深度发展，各地区经济鱼类养殖出现互融互通的发展新模式，近交、迁徙、过度捕捞、养殖种群逃逸等因素对各地区鱼类种群结构产生了深刻的影响
种质鉴定能反映鱼类种群资源状况，查明原始种群与养殖种群的遗传结构和变异情况，从而确定原种保护和开发利用措施
伴随着鱼类种群遗传学的发展，种群鉴定已由形态学鉴别发展到蛋白质和DNA分子水平，花鲈俗名鲈鱼、七星鲈、寨花等，广泛分布于我国沿海以及朝鲜沿海，是我国重要的海产经济鱼类
花鲈具有广温、广盐性的特性，在海淡水中均适合养殖，为南北方沿海网箱及池塘养殖的主要对象之一，养殖规模逐步扩大
花鲈的发展特征自20世纪80年代，基于形态学的特征，中国花鲈和日本真鲈(L.japonicus)被划分为一个属，2001年，中国花鲈被命名为L.maculatus
相比于日本真鲈受地理区域的限制，中国花鲈分布更广泛，南到中国–印度半岛，北到渤海湾
中国花鲈种质资源构成较为复杂，由于自然迁移和外部地理环境等原因，形成众多不同的地理群体
关于花鲈群体遗传结构研究多有报道，包括基于随机扩增多态DNA(RAPD)技术及微卫星DNA标记的分析、细胞色素b基因和控制区域的分析、线粒体基因组分析等
随着高通量测序技术的快速发展，许多高效快捷的工具用于全基因组范围内的种群遗传研究，包括简化基因组测序技术
近年来，越来越多的养殖者认为，源自黄、渤海的花鲈苗种生长快、抗病性强，日本、韩国及广东、福建等花鲈养殖地区大量购买中国北方花鲈苗种来进行人工养殖
北方地区花鲈苗种的大量推广养殖，导致中国不同地区的花鲈群体种质愈加不清晰，本研究在对中国自然海域12个花鲈野生群体遗传结构分析结果的基础上，利用ddRAD简化基因组测序技术对我国花鲈养殖群体进行遗传结构分析
之后对我国花鲈主要养殖地区的种质来源进行鉴定区分，为后续的花鲈品种选育工作提供依据
材料与方法以及实验材料实验样品采自山东、浙江、福建、诏安县、东山县和广东
诏安县样本规格为鱼苗，其他样本均为幼鱼，分别命名为QD、DY、NB、FD、ML、QDZ、DS和DM
上述地区采集的样本数共计86个，采用200mg/L的MS-222将花鲈麻醉后，取腹部鳍条，保存于装有无水乙醇的1.5mL的离心管中
数据采集与分析在采集鳍条后，分别于3h、6h、24h、72h、7d、30d更换无水乙醇，以保证样品DNA的质量
基因组DNA提取花鲈基因组DNA采用传统的酚–氯仿法提取，将切碎的组织与500μL细胞裂解液和20μL蛋白酶K(20mg/mL)在56℃条件下裂解2h(期间每隔0.5h混匀一次，直至离心管中液体彻底澄清
然后在37℃条件下加入2μLRNaseA(100mg/mL)，反应30min，随后用等体积的Tris-平衡酚分离蛋白质和DNA，并用等量的氯仿/异丙醇混合溶液(24∶1)再次提取DNA
在–20℃条件下沉淀2h，离心收集基因组DNA，用70%乙醇洗涤2次，晾干，并重悬溶解于20~80μLDEPC水中
随后使用NanoDrop2000对样品DNA浓度进行测定，合格DNA样品A260/280和A260/230值分别在1.8~2.0、2.0~2.2范围
我们再用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA完整度，DNA样品–20℃保存备用，1.3ddRAD文库构建ddRAD文库制备方法参照Peterson等的研究
用EcoRⅠ-HF和MspⅠ消化每尾鱼的2.5μg基因组DNA，将带有正向扩增引物和barcode并与EcoRⅠ-HF酶切位点连接的P1接头，以及带有反向扩增引物并与MspI酶切位点连接的P2接头进行连接，然后通过PCR进行检测
随后将86个样品混合为4份，加入AmpureXP磁珠进行纯化，采用E-Gel系统电泳，回收255~430bp的DNA片段，随后进行30个循环的IndexPCR扩增
我们再利用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒回收PCR目的片段，本实验共建立4个ddRAD文库，经Agilent2100生物芯片分析系统检测合格后，采用150bppaired-end策略使用IlluminaHiSeqXTen平台进行测序
实验组合与参数SNP位点挖掘及分型依据不同个体特殊的barcode-index组合，利用Stacksv1.46软件对cleanreads数据进行个体区分
过滤去掉质量低的reads(qualityscore<10)和模糊不清的RAD-Tag，删除每条reads130bp以后的序列，允许碱基错配数为1
自NCBI数据库中下载花鲈基因组数据，使用BWA软件将分析个体的RAD-tags与花鲈基因组进行比对，转化生成文件
然后按照Stacks的标准流程进行SNP挖掘，利用PLINK软件过滤掉不符合要求的SNP位点，0.05作为最小等位基因频率的阈值，保留下来的位点需在超过80%的分析个体中都分型成功
群体遗传结构分析对以上养殖群体样本测序分型，得到23,258个SNP分型，结合对12个花鲈野生群体渤海湾、黄海、东海、南海和北部湾海康港HKG、铁山港TSG和防城港FCG，成功分型的SNPs信息，对20个花鲈群体遗传结构进行分析
我们的主成分分析使用SNPRelateR软件包中的snpgdsVCF2GDS函数进行主成分分析，使用snpgdsPCA函数计算特征向量的值
采用Galinsky提出的随机算法来简化运算，PCA结果使用ggplot2R语言包进行绘图展示，遗传组分分析首先使用PLINK软件进行群体结构分析，Maxiter及threshold参数均设置为10000
计算个体数量为2、3、4三种情况下的结果，结果使用R语言中的barplot函数进行绘制
遗传分化分析利用GenAIEx6.5软件计算遗传分化指数(Fst)、基因差异分化系数(Gst)和遗传距离(Dest)值评估群体间的遗传分化，其中每个群体的SNPs损失率设置为小于25%
结果SNP位点筛选本研究对养殖群体来源的86尾花鲈的DNA样本进行ddRAD文库构建，经测序共获得了rawdata数据83G
数据筛选经过初步数据过滤，3个个体因数据量过少被剔除，BWA基因组比对的平均mappingratio为90.32%，个体平均基因组覆盖度为1.1%，个体平均测序深度为33X
共获得83尾个体的23258个SNP位点用于后续的遗传结构分析，花鲈养殖与野生群体的遗传结构分析，对本研究SNP分型成功的养殖群体，以及83尾花鲈个体和野生群体来源的219尾个体，进行PCA分析和遗传组分分析
我们对野生群体的主成分分析结果表明，渤海湾和黄海北部的3个群体(天津、烟台和文登)及北部湾的3个群体(海康港、铁山港和防城港)形成2个不同的分支
将其分别定义为北方群体和南方群体，剩余群体(连云港、吕四、舟山、温州、汕头和湛江)形成另一个分支，定义为中部混杂群体
本研究PCA结果显示，山东、浙江、福建和广东地区的8个养殖群体均与野生花鲈群体间存在遗传差异
而从第1主成分来看，8个养殖群体与天津、烟台和文登的野生群体间遗传差异较小，表明其遗传关系最为接近
遗传组分分析结果显示，K值为2时，8个养殖群体与天津、烟台和文登的野生群体间的遗传差异较小，进一步验证了主成分分析的结果
K值设置为3和4时，群体间遗传差异虽更加明显，但出现了不同程度的融合现象，最佳聚类K值为2
花鲈养殖群体间的遗传结构分析对8个养殖花鲈群体进行遗传结构分析，PCA分析结果显示
除福建省漳州市梅岭镇养殖群体外，其他7个养殖群体(青岛、东营、宁波、福鼎、福建省漳州市桥东镇、福建省漳州市东山县和斗门)的样本聚集在一起，只有梅岭镇与其他养殖群体的遗传差异相对较大
遗传组分分析结果表明，K值为2时，聚类效果较好，梅岭镇养殖群体与其他养殖群体间具有较大的遗传差异
与上述PCA分析结果一致
随机选取8191个高质量的SNPs用于养殖群体的遗传分化分析，群体间的遗传分化用3个值(Fst、Gst、和Dest)来估测
群体间的Fst范围为0.025~0.051，Gst范围为–0.003~0.040，Dest范围为0~0.004，部分花鲈群体间出现了显著的遗传差异
ML、QDZ和其他群体间Fst值均<0.05，群体间的遗传差异是显著的，综上所述，虽然8个花鲈养殖群体间遗传差异较小，但其内部也出现了群体分化，其中以福建梅岭镇地区的养殖花鲈群体与其他群体的遗传距离最远
分类研究关于花鲈种群遗传的研究较多，但方法不尽相同，以往的研究主要基于有限数量的微卫星标记、线粒体DNA序列及SNPs标记的研究
此外我们用全基因组SNPs对中国沿海自然分布的野生花鲈群体进行了较为精确的群体遗传结构分析，证实了黄、渤海和北部湾的野生群体间具有较高的遗传差异，并定义了北方、南方和中间混合群体
本研究利用ddRAD技术，基于全基因组发掘的SNP标记对8个不同地理来源的花鲈养殖群体的遗传结构进行分析，以明确我国主要养殖花鲈的种质来源
PCA分析结果表明，山东、浙江、福建和广东地区的8个养殖群体均与野生花鲈群体间存在较显著的遗传分化
而从第1主成分来看，8个养殖群体与天津、烟台和文登的渤海湾和黄海北部野生群体间遗传差异较小，表明其遗传关系较近，该结果与花鲈养殖过程中亲鱼与种苗流动的整体情况相符
花鲈是我国水产养殖的优良品种，由于其广温、广盐性及较强的抗逆能力，分布较为广泛
与其他地理群体相比，高纬度的渤海湾和黄海北部花鲈群体生长性状较好
因此大量花鲈养殖苗种由黄、渤海来源的亲鱼经人工繁育获得，然后被运送到中国其他地区进行网箱和河口地区池塘养殖
此外我们对本研究的8个花鲈养殖群体进行了单独的遗传结构分析，结果表明，养殖群体间遗传差异较小，但也出现一定程度的遗传分化
其中漳州地区的桥东镇和梅岭镇的2个养殖群体，与其他养殖群体间Fst值出现显著差异
本研究结果也与当地花鲈养殖实际情况相符，桥东镇和梅岭镇所属的漳州市是一个特殊的花鲈养殖地区，花鲈亲鱼的来源较广
其中包括当地养殖亲鱼群体以及北方苗种培育后的亲鱼群体，同时漳州得天独厚的天然优势使其成为我国花鲈商品鱼和苗种流通的一个中转站，导致其花鲈群体来源背景更为复杂
我们对我国沿海花鲈野生群体研究结果表明，12个群体间的遗传分化程度较低，Fst平均为0.030(范围为0.015~0.057)
最低的差异出现在渤海湾群体间，而最高的差异出现在铁山港和烟台的野生群体，与以上研究结果相似，本研究结果显示，各养殖群体间遗传分化程度也较低，Fst平均为0.034，最低的差异出现在东营与东山、福鼎群体间，而最高的差异出现在梅岭镇和桥东镇的养殖群体
同样较低的遗传分化已经在海洋物种，如瓦氏雅罗鱼、欧洲鲈鱼和潮间带蜗牛的研究中报道
在海洋物种中，高群体扩散可以促进基因流动和遗传混合，这与大的空间规模下轻微的遗传差异相关
低遗传分化表明，中国花鲈养殖群体存在大量的基因流动和遗传混合，本研究对中国花鲈主要养殖地区的种群结构进行鉴定区分，丰富了鱼类群体遗传多样性的研究方法，可为后续花鲈品质资源的保护、育种工作提供依据