引言中华软壳龟是中国重要的淡水养殖品种。
与雌性相比，雄龟的体重和体型明显更大，哈里发更厚更宽，脂肪水平更低。
与其他爬行动物和哺乳动物类似，软壳龟具有将精子储存在卵巢中的能力。
在海龟中，精子发生交配和排卵是季节性和隔离性的。
以前的许多研究都集中在海龟的性别决定和分化上。
然而，据我们所知，没有研究探索软壳龟生殖发育的遗传机制。
摘要调节性ncRNA根据转录本大小可分为三类：小（sncRNA）、中和长（lncRNA）。
MicroRNA（miRNA）是一类丰富的sncRNA（~22nt长），在信使RNA（mRNA）水平上负向调节基因表达。
MiRNA通过与靶标3′非翻译区（UTR）中完美或不完美的互补序列结合并触发靶标降解或抑制其翻译，在转录后水平调节基因表达。
LncRNA构成大量多样的转录非蛋白质编码RNA分子，长度超过200个核苷酸。
众所周知，lncRNA在转录和转录后水平上影响表达的上调和下调。
LncRNA通过表观遗传修饰、转录和转录后修饰通过DNA甲基化、组蛋白修饰和染色质重塑来调节基因表达。
LncRNA还可以结合富含启动子的典型转录因子结合位点，这些转录因子结合位点调节基因表达。
研究提供了lncRNA调节哺乳动物生殖过程的证据，包括生殖细胞规格、性别决定、性腺发育、配子发生、胎盘形成和影响生殖组织的病理。
敲除lncRNA可导致果蝇雄性生育能力部分或全部丧失。
在小鼠中，

mrhl RNA可以负调节Wnt信号传导，并在精原细胞的减数分裂进展上下调。
在大型蚤中，lncRNA Dapalr可以反激活和维持dsx1表达，从而对环境刺激产生雄性。
在雌性哺乳动物中，lncRNA在生育能力中也起着重要作用。
H9敲除雌性小鼠表现出卵泡生成改变和滤泡闭锁增加，这可能是由于缺乏H9通过结合Amh mRNA的3′UTR来降低Amh的表达。
尽管miRNA和lncRNA已被证明可以调节哺乳动物组织的发育和繁殖，但人们对它们在性腺中的性二态性以及龟科和其他爬行动物的繁殖知之甚少。
本研究以中华假单胞菌为研究对象，探讨新型ncRNA在性二态性和生殖中的应用。
本研究结果可为更好地了解miRNA和lncRNAs在龟卵巢和睾丸中的作用提供依据，从而开发中国软壳龟的繁殖机制。
测序数据概述我们使用来自卵巢和睾丸的RNA构建了miRNA，mRNA和lncRNA的cDNA文库。
在过滤掉低质量的转录本、5' 和 3' 适配器并在 18 nt <读取后，Illumina 技术总共产生了 113.5 M 的 miRNA 清洁读数。
21和22 nt长度的转录本最丰富，60.4%的高质量读数被映射到海龟基因组（Pelsin-1.0，NCBI）。
我们获得了153.25 Gb的mRNA和lncRNA测序的干净读数。
lncRNA和mRNA的长度分布如图所示。
1b和c.在绘制基因组图谱后，大约84.41%~87.72%的读数被定位到P. sinensis参考基因组中的基因间区域。
鉴定 mRNA、miRNA 和 lncRNA 的差异表达根据miRNA表达谱，我们检测到10，446个新型miRNA。
共有633个miRNA在卵巢和睾丸之间有显著差异表达（P < 0.05），包括138个上调miRNA和495个下调miRNA。
这些DEmiRNA属于438个家族。
在这些DEmiRNA中，我们鉴定了一组据报道调节动物繁殖的miRNA，包括miR-133，miR-138，miR-145，miR-143和miR-378。
DEmiRNA和DElncRNA的功能分析为了注释差异表达miRNA的分子功能，使用RNA杂交和MiRanda软件来改进miRNA靶标的预测，从而产生了8088个靶基因，其中包括2814个差异表达基因，这些基因可能受到633个DEmiRNA的调控。
根据以下三个本体将miRNA和lncRNA的GO类别分配给所有靶基因：细胞成分，分子功能和生物过程。
靶基因在细胞成分类别中的功能主要集中在细胞部分、细胞和膜上。
基于分子功能，最丰富的靶基因集中在结合上，其次是催化活性。
在生物过程方面，最丰富的靶基因集中在单个生物过程，其次是细胞过程和生物调控。
KEGG通路富集分析显示，DEmiRNA参与186条信号通路架的调节有关。
DEmiRNA最丰富的靶基因集中在乙醛酸和二羧酸代谢上。
我们检测到至少13条参与生殖生物学的途径，包括卵母细胞减数分裂，TGF-β信号传导。
卵巢类固醇生成，GnRH信号传导，Wnt信号传导，cAMP信号传导，类固醇生物合成，类固醇激素生物合成，MAPK信号传导，p53信号传导，RNA聚合酶，细胞色素P450代谢异生素和mTOR信号传导。
差异表达的miRNA和lncRNA的验证为了验证miRNA和lncRNA的测序数据，随机选择1361个DEmiRNA和2322个DElncRNA来测试它们在卵巢和睾丸中的相对表达。
6721个miRNA和10个lncRNA在卵巢和睾丸中的表达与RNA测序结果一致。
在miRNA中，novel-miR-042，novel-miR-10，novel-miR-231，novel-miR-10，322，novel-miR-10，468，novel-miR-1236，3和novel-miR-435295，1在睾丸中下调，而novel-miR-88998在睾丸中上调。
在lncRNA中，MSTRG.127189.1、MSTRG.100955.1、MSTRG.129036.2和MSTRG.281180.2在睾丸中上调，而MSTRG.561412.1、MSTRG.3.<>和MSTRG.<>.<>在睾丸中下调。
这些miRNA和lncRNA在不同组间的表达模式与RNA-Seq数据吻合较好，可以保证后续功能分析的准确性。
竞争内源性（ceRNA）网络的构建为了构建ceRNA网络，我们筛选了包含miRNA反应元件的miRNA，这些miRNA可以与lncRNA和mRNA结合。
我们通过整合高通量测序数据中mRNA、lncRNA和miRNA之间的表达谱和调控关系，构建了一系列与DE基因相关的mRNA、miRNA和lncRNA的ceRNA网络。
这些网络包括102个DEmiRNA，635个DEmRNA和1621个DElncRNA。
DEmiRNA包括novel-miR-227、novel-miR-9914、novel-miR-6375、novel-miR-1222、novel-miR-6721、novel-miR-2026、novel-miR-6671、novel-miR-642、novel-miR-6319和novel-miR-42等。
这些ceRNA网络包括一组调节繁殖的mRNA。
例如，Dazl mRNA和MSTRG.71049.8共享miRNA小说miR-1222的共同结合位点。
我们还在ceRNA网络中鉴定了Wt1，CREB3l2，Gata4，Wnt2，Nr5a1，Hsd17，Igf2r，H2afz，Lin52，Trim71，Zar1和Jazf1。
这些miRNA和mRNA参与调节生殖过程，包括减数分裂和精子发生。
样品采集和 RNA 分离本研究中的所有研究均根据中国大学伦理委员会的动物实验指南进行。
从中国信阳晨源水产养殖有限公司获得600只成年雌龟（体重45±750克，平均标准±标准偏差）和50只雄龟（体重24±2004克），它们年龄2个月，在同一池塘养殖。
根据《实验动物管理条例》收集样本。
为了尽量减少的痛苦，每只都用过量的80毫升麻醉剂（2-苯氧基乙醇;Sigma-Aldrich）通过腹膜内给药，并在生殖季节前通过颈椎脱位处死。
睾丸和卵巢在屠宰后获得，并立即储存在-0°C。
使用TRIzol试剂（美国Invitrogen）从每个性腺样本中分离总RNA。
使用 Nanodrop、Qubit 2100.7 和安捷伦 3 生物分析仪测定 RNA 浓度和质量。
将更高质量的RNA（RIN的值范围为7.7至80.3）储存在-3°C用于文库构建。
将雄龟和雌龟分成三组，汇集三只海龟的RNA。
构建了来自睾丸（n = <>）和卵巢（n = <>）的六个miRNA和lncRNA文库。
文库制备和测序使用每只海龟性腺样本 2.5 ng 的 RNA 构建 MiRNA 测序文库。
该文库是按照制造商对 Illumina 的 NEB Next 超小 RNA 样品库制备试剂盒（美国 NEB）的说明构建的。
简而言之，3′ SR接头通过3′连接酶混合物连接，并使用SR RT引物防止接头二聚体形成。
之后，连接5′ SR接头，并进行逆转录以合成第一条链。
然后，以合成的第一链cDNA为模板，通过RT-PCR扩增靶片段，并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离构建文库。
使用安捷伦 2100 生物分析仪对文库进行了评估。
根据制造商的说明，使用TruSeq PE集群套件v4-cBot-HS（美国Illumina）在cBot集群生成系统上对索引编码样本进行聚类。
之后，准备好的文库在Illumina HiSeq X Ten平台上进行测序。
转录组组装使用HISAT1和Bowtie软件将干净的读数映射到海龟基因组v2.56（PRJNA57，NCBI）。
根据基于参考的方法，使用字符串领带组装每个样本的映射读数。
对于鉴定出的miRNA，将组装好的转录本与ncRNA（rRNA，tRAN，snRNA，snoRNA和其他ncRNA）进行比较，并使用Bowtie软件重复。
表达分析计算每个样品中miRNA的表达水平，并使用每百万分之一的转录本进行标准化。
蛋白质编码基因和lncRNA的表达水平计算为每百万个片段每千基外显子片段，并使用Cuffdiff（v2.1.1）进行映射和评估。
使用DEGseq软件包对miRNA、lncRNA和mRNA进行差异表达基因（DEGs）分析。
对于DEmiRNA，DEmRNA和DElncRNA，≤确定错误发现率（FDR）0.01和log2（倍数变化，FC）的绝对值≥1。
生物信息学分析为了预测miRNA和lncRNA的功能，将靶基因和差异表达基因与NCBI非冗余蛋白数据库（Nr）、基因本体（GO）数据库、京都基因和基因组百科全书（KEGG）以及直系同源蛋白质组簇进行了注释。
KS ≤0.05 的 GO 项和校正 P ≤ 0.05 的途径被定义为显著富集。
结论在动物中，miRNA和lncRNA作为主调节因子通过控制mRNA的表达来调节生殖过程。
考虑到它们的重要性，在中华假单胞菌中鉴定出的miRNA、lncRNA及其靶标可能有助于研究有性生殖和基因组编辑所涉及的分子过程，以生产更高质量的水产养殖动物。
深入了解基于ncRNA的细胞调控网络将有助于改善用于水产养殖的中华假单胞菌繁殖性状。
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