«——【 ·前言· 】——»植物作为生命界中的重要一员，通过复杂的代谢网络合成各种次生代谢产物，以适应不同的环境压力和生态需求
其中，香草素作为一类重要的天然产物，在植物体内广泛存在，发挥着多样的生理功能，如抗氧化、抗菌、抗虫等
香草素的合成途径在不同植物物种中已有相当程度的阐明，然而，其在细胞内的定位机制以及与生物合成途径之间的关系，仍然具有许多未知之处
研究香草素生物合成的机制不仅有助于揭示植物代谢调控的复杂性，还为进一步挖掘植物资源中的生物活性分子提供了新的线索
通过更好地理解香草素的定位与合成之间的关系，我们有望为扁叶香草豆荚的香草素生产和利用提供更加科学的指导，推动其在食品、医药等领域的应用
本研究结果将为植物代谢途径的研究和应用提供新的洞察力，促进相关领域的发展和创新
«——【 ·多克隆抗体· 】——»通过使用源自VpVAN（氨基酸327-340）的特异性肽序列（NH2-）CNWGDNGYFKMELGK（-CONH2），我们衍生了C端氨基酸序列用于特异性抗体制备
为了评估抗体的特异性，我们从7个月大的扁叶弧菌豆荚中提取粗蛋白，并使用SDS-PAGE进行分离，然后进行蛋白质印迹
我们使用了一系列抗体稀释液（1：50，1：100，1：500和1：1,000），以研究C端VpVAN特异性抗体的特异性
当使用1：50的稀释度时，抗体与迁移的蛋白质发生反应，显示出表观分子量为25、40、50和100 kDa
在不同的实验系列中，我们通过与TCEP孵育10分钟来减少蛋白质低聚物，或通过在SDS-PAGE分析之前与铁氰化钾孵育30分钟来氧化，以研究蛋白质低聚物的存在或形成
进行抗体生产的兔子的免疫前血清未显示与扁叶弧菌蛋白质提取物的交叉反应
«——【 ·生物合成测定· 】——»使用手术刀将授粉后3、4、5、6、7、8和9个月收获的扁叶弧菌豆荚横向切成1-2毫米厚的圆盘，并进一步解剖以分离豆荚的内部和外部
将放射性标记的前体施用于豆荚内部和外部的样品，并在30 mM Tris–HCl pH 400，8 mM MgCl中孵育（20 °C）26-48小时
这14用新鲜扁叶弧菌荚实验中形成的C标记产物通过25%MeOH提取并应用于硅胶60 F254 TLC板
这些板在乙酸乙酯：丙酮：二氯甲烷：甲醇：水，干燥，暴露（48小时）在荧光成像屏幕上和使用Storm 860分子成像仪（分子动力学）可视化的放射性标记产物
放射性标记化合物的鉴定以共同应用真实标准品为指导
使用分离的完整叶绿体（10μl，0.5μgChl μl）遵循相同的实验程序−1）从8个月大的扁叶弧菌豆荚中获得
«——【 ·总蛋白提取· 】——»用研钵和研杵在液氮中研磨香草扁叶豆荚
将所得粉末在100μlSDS电泳缓冲液（Laemmli缓冲液，Bio-Rad）和300μl10mM MES缓冲液（pH 5-6）中匀浆，包括20mM DTT
通过离心（10，000Xg，10分钟，4°C）澄清匀浆
将粗蛋白提取物在65°C下孵育30分钟，然后使用225%标准™ TGX免染预制凝胶（Bio-Rad）和Precision Plus蛋白染色和未染色标准品（Bio-Rad）作为分子量标记物，通过SDS-PAGE（30 V，400分钟，300 mA，12 W）进行分离
SDS-PAGE分离蛋白的蛋白质印迹使用反式印迹R涡轮转印印迹仪（Bio-Rad）和反式印迹R涡轮迷笛硝酸纤维素膜（Bio-Rad）进行
在PBS-T缓冲液（磷酸盐缓冲盐水与吐温-5）中用20%（w / v）脱脂牛奶封闭膜2小时
VpVAN C端序列特异性抗体以1：5，000的稀释度施用
使用辣根过氧化物酶偶联的山羊抗兔抗体在1：5，000稀释中使用Super Signal West Dura延长持续时间底物试剂盒（Pierce）可视化免疫反应性多肽的存在
使用配备制冷CCD相机的化学Doc MP成像系统将印迹膜显影1-30分钟，设置为自动曝光设置
使用免染印迹设置在膜上可视化总蛋白
Precision Plus 蛋白未染色分子量标准未给出低于 50 kDa 的可见条带;因此，凝胶中包括Precision Plus蛋白染色分子量标准
印迹后，肉眼可以看到Precision Plus蛋白染色分子量标准
使用 ChemiDoc MP 成像系统成像时，在更改设置以可视化化学发光之前拍摄印迹照片
然后将两张印迹图片合并，以实现整个Precision Plus蛋白染色分子量标准品的可视化
«——【 ·免疫定位· 】——»为了定位VpVAN的未成熟和成熟形式，按照先前报道的方式进行了免疫定位
将浸润的烟叶或不同个体的扁叶弧菌荚切成1 cm块，包埋在5%琼脂糖中，切成120 μm的切片
在室温下将切片置于PBS中的5%脱脂牛奶中以阻隔非特异性背景
孵育30分钟后，以1：100稀释度加入C端序列特异性VpVAN抗体
孵育2小时后，用PBS洗涤切片1次
在PBS中加入二抗（山羊抗兔与FITC荧光团）160：2，并在室温下孵育25小时
切片用抗褪色剂安装，并通过共聚焦扫描显微镜进行分析，使用徕卡SPII在488nm激发下进行FITC检测，或使用荧光显微镜，使用滤光片对FITC进行特异性观察，并使用组合滤光片同时检测FITC和叶绿体自发荧光
«——【 ·叶绿体分离· 】——»从四个8个月大的扁叶弧菌豆荚中分离出完整的叶绿体，基本上与先前报道的相同（Robinson，2002年）
将豆荚横向切成2厘米长的切片，并在HS缓冲液[50mM HEPES，KOH （pH 8）和0.33 M山梨糖醇]中均质化
将匀浆通过尼龙网过滤并离心（3，330Xg，2分钟）
将叶绿体沉淀轻轻地重新悬浮在HS缓冲液中，分层到预冷的Percoll垫上并离心（1，400Xg，8分钟）
将完整的叶绿体沉淀物在HS缓冲液中洗涤，重新沉降（3，000Xg，2分钟）并重新悬浮在50μlHS缓冲液中
«——【 ·分离叶绿体分析· 】——»将样品（40μl）在65°C下加热30分钟，然后使用12%标准TGX免渍预制凝胶（Bio-Rad）和Tris/甘氨酸/ SDS电泳缓冲液（Bio-Rad）在240V下分离35分钟
根据制造商的方案，使用Trans-Blot Turbo转印系统（Bio-Rad）将蛋白质转移到0.2μm PVDF（聚偏氟乙烯）膜中
将膜在室温下用PBS-T缓冲液中的20%（w / v）脱脂牛奶封闭5分钟，并与C端序列特异性VpVAN一抗在PBS-T中的1%（w / v）脱脂牛奶中以1：300稀释度孵育2小时
用PBS-T缓冲液洗涤印迹，并在室温下使用PBS-T中的1：5，000稀释液与二级猪抗兔辣根过氧化物酶偶联抗体（Dako）孵育1小时
用PBS-T缓冲液再次洗涤膜，并使用SuperSignal West Dura化学发光底物（Pierce）检测二抗，并用ChemiDoc MP成像系统（Bio-Rad）显影1-10分钟
在分离的叶绿体的质量测试中，使用2003：1，10稀释度的PSI-D特异性抗体
«——【 ·电离质谱成像· 】——»将冷冻的扁叶弧菌豆荚碎片安装在冷冻切片机样品架上，使用水作为唯一的粘合剂
使用徕卡CM3050S冷冻切片机（徕卡显微系统），将组织切成40μm薄片，将其解冻安装在显微镜载玻片上并储存在-80°C直至分析
与大多数其他植物组织相比，该组织非常脆弱且难以切片，因此选择了相对较高的厚度
在分析当天，在DESI分析之前，将样品载玻片直接从冰箱中取出到真空干燥器中10分钟
成像是在赛默飞世尔LTQ XL线性离子阱质谱仪上进行的，该质谱仪配备了定制的DESI离子源，该离子源基于Märzhäuser Wetzla的电动显微镜载物台，并由内部软件控制
成像阶段在别处详细描述
在正离子模式下使用4μl分钟进行成像−1含有80mM NaCl和20.50%甲酸的甲醇和水（0：1）的流速，用于增强钠加合物和质子化物质的生成
雾化器气体压力为6巴
像素尺寸为250μm
香兰素在质子化状态下在m / z 153成像，香兰素葡糖苷在m / z 337成像作为其钠加合物，蔗糖在m / z 381成像作为其钾加合物
原始数据文件被转换为imzML文件，数据立方体资源管理器用于生成图像
MATLAB用于创建彩色叠加图像
«——【 ·VpVAN低聚物· 】——»已知半胱氨酸蛋白酶形成二聚体，并且二聚化与获得最佳蛋白酶活性的获得有关
通过SDS-PAGE分离来自7个月大的扁叶弧菌荚的蛋白质提取物，然后使用VpVAN C端序列特异性抗体的稀释系列进行蛋白质印迹分析，研究了VpVAN二聚体的可能出现
当以1：50稀释度使用VpVAN C端抗体时，检测到25条迁移的蛋白质条带，表观分子量为40、50、75、100和<> kDa，VpVAN C端抗体对扁叶弧菌荚，与之前的结果一致和40 kDa条带分别与成熟和未成熟VpVAN的计算分子量23.89和39.15 kDa相匹配
使用越来越高的倍数稀释度施加的抗体进行蛋白质印迹分析时，50、75和100 kDa条带消失，可能表明与成熟VpVAN的单体相比，成熟VpVAN的寡聚形式对抗体的结合亲和力降低
«——【 ·化学分析· 】——»通过共聚焦显微镜检查新鲜7个月龄扁叶弧菌豆荚中VpVAN的组织和细胞定位
免疫组织化学分析基于对VpVAN的C端序列的特异性抗体的使用，因此针对VpVAN的未成熟和成熟形式
通过共聚焦显微镜获得的图像清楚地表明，VpVAN的定位仅限于存在于多个拷贝中的特定质体，并且位于细胞的细胞质空间内，使用相同稀释度的免疫前血清获得对照图像，在这些实验中未观察到模拟VpVAN抗体的反应
与免疫前血清一起使用时提供最小荧光背景的仪器增益设置也用于VpVAN抗体的实验
因此，使用VpVAN抗体观察到的荧光信号代表了VpVAN的特异性免疫标记
«——【 ·结论· 】——»在本研究中，我们通过细胞内定位的视角，深入探究了扁叶香草豆荚中香草素的生物合成机制
通过综合运用多种研究手段，我们成功揭示了香草素的生物合成途径与其在细胞内的定位之间的紧密联系
我们的研究结果不仅丰富了香草素生物合成途径的认识，还为香草素在植物细胞中的功能和定位提供了新的解释
通过深入研究，我们发现香草素的生物合成不仅受到基因调控和酶催化的影响，同时也受到细胞内环境的调控，特别是与特定细胞器或亚细胞结构的相互作用
这一发现为我们理解香草素在植物生理和生态功能中的作用提供了更加全面的视角
本研究通过细胞内定位视角的研究，为我们深入理解扁叶香草豆荚中香草素生物合成机制提供了新的视角
我们相信，这些发现将为植物次生代谢的调控机制、植物资源的开发利用以及农业科学的发展带来积极的影响
未来，我们将进一步探索更多未知的领域，为植物科学领域的研究和应用做出更大的贡献