PCR反应是分子生物学最基本的实验之一，影响PCR结果的主要因素之一就是引物设计。前两期小编给大家介绍的两款软件SnapGene和DNAMAN就都能够用于设计引物。但要说到最专业的引物设计软件，大家肯定首先想到Primer Premier 5，这里小编给大家带来的是这款软件的升级版Primer Premier 6。01软件安装介绍软件的安装之前先预警一波，Primer6的安装稍显复杂，请小伙伴们严格按照小编说的操作，否则可能会出现软件无法激活的情况。01安装Java控制台由于软件的补丁是一个Java程序，安装软件之前需要在电脑中安装Java控制台。网址是http://java.com/zh_CN/download/manual.jsp（可能需要翻一下才能进入），注意32/64位的要区分开来，可进入自己的电脑属性里边查看自己的电脑位数并下载对应的Java，下载好后安装，安装完成后最好重启下电脑。如果大家的电脑是64位系统，并且恰好安装有360的话（真的不是打广告~），也可以直接在360软件管家中搜索Java，直接安装一个Java控制台。图片来源：软件截图02安装Primer6软件解压后会有三个文件，Primer6的安装包PP600Installer和激活补丁Patcher，还有一个说明文档crack。直接点击PP600Installer安装，需要注意的是，一定要将软件安装到以下路径C:\Program Files。尤其是64位系统，不要直接安装到Program Files（x86）。安装完成后先关闭软件。图片来源：软件截图03安装补丁将上述激活补丁Patcher文件复制到以下文件夹C:\ProgramFiles\http\Dwww.premierbiosoft.com\P80\DMIUpdater\DMPP\DM600。大家可以在C盘【Program Files】文件夹下新建【http】文件夹，然后在【http】文件夹下再新建【Dwww.premierbiosoft.com】文件夹，以此类推，最后将Patcher文件复制进去即可。对cmd命令行熟悉的朋友也可以尝试用cmd命令行进行操作。（32位系统按照以下路径操作【C:\Program Files\Primer Premier 6.0\http\Dwww.premierbiosoft.com\P80\DMIUpdater\DMPP\DM600】）最后重点来了，完成上述步骤后，以管理员身份运行cmd。方法是左下角搜索cmd，单击鼠标右键，选择以管理员身份运行。图片来源：软件截图打开cmd命令行后，先输入Java命令，若出现以下界面则说明电脑中已顺利安装Java。图片来源：软件截图然后继续在光标后面输入以下命令：cdC:\ProgramFiles\http\Dwww.premierbiosoft.com\P80\DMIUpdater\DMPP\DM600，回车，之后在出来的界面后边输入java -jar patcher.jar，看到cmd中出现Done，说明软件就已经顺利激活了。（32位系统相应的命令改为cd C:\Program Files\Primer Premier6.0\http\Dwww.premierbiosoft.com\P80\DMIUpdater\DMPP\DM600）图片来源：软件截图02软件使用01软件界面Primer6的界面相对于Primer5改动较大，主要包括主菜单，工具栏和序列栏三部分。图片来源：软件截图02引物设计单击菜单【File】→【New】→【Sequence】，将需要设计引物的序列粘贴进去，点击【Add】，即可导入序列。图片来源：软件截图点击工具栏中的引物设计按钮，设置好Tm值，引物长度，扩增产物长度等参数，有需要的话也可以在高级设置中选择更多其他参数。设置好后点击Search，即可生成引物。图片来源：软件截图引物生成后会出现引物的具体信息，包括引物序列、位置、长度、Tm值等信息，并在序列窗口标出了具体的信物位置。点击All Primers，则会出现更多的引物序列，点击All structures则会显示引物可能形成的引物二聚体（Self Dimer）、发卡结构（Hairpin）、引物错配（Cross Dimer）、自由能（△G，自由能越小越稳定，因此△G越大引物效果越好）等信息。通常我们选择默认的引物即可。图片来源：软件截图03在线引物设计鉴于Primer6的安装相对复杂，这里小编也介绍两个常用的引物设计网站，不想捣鼓上面一通操作的小伙伴也可以直接在线设计引物。01 Primer 3 (https://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)Primer3的操作与上述Primer6的操作基本一致，粘贴序列后，通常只需要选择引物长度即可生成引物。输出的结果中也含有引物序列、长度、Tm值等信息。图片来源：软件截图02Primer-BLAST(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast)这是NCBI网站中的引物设计工具，操作与Primer3基本一致，小编之前也介绍过这个网站（NCBI网站的小彩蛋）。primer-BLAST最大的优势在于系统会将你扩增的片段在NCBI数据库中进行BLAST比对，为你筛选出最特异的引物。引物设计的结果同样有两个，引物位置示意图和详细的引物信息。这个小工具结合了primer3和BLAST的优势，尤其适用于设计qrt-PCR引物。图片来源：软件截图图片来源：软件截图结 语 最后小结一下，Primer6相对于Primer5其实提升并不大，只是多了一个SNP分析的鸡肋功能，反而还去掉了酶切位点分析的功能。对于一般性的设计引物，用在线的Primer3或者Primer-BLAST就够了。也欢迎大家在我们的科研交流群中积极讨论。
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