优化后的MRS培养基使摇瓶发酵活菌数提升了58.79 %
​​摘要：在成功筛选到一株猪源粪肠球菌HEW-A317后，本文首先在MRS培养基的基础上对该菌进行了培养基优化
先进行单因素优化，后进行正交设计实验，最终得的最优培养基组合为：葡萄糖3.0 %、蛋白胨3.0 %、MnSO4·H2O 0.07 g/L、酵母粉1 %、无水乙酸钠1.4 %、柠檬酸氢二铵0.5 %、MgSO4·7H2O 0.2 %、K2HPO40.2 %、吐温80 0.4 %
优化后的MRS培养基使摇瓶发酵活菌数提升了58.79 %
关键词：粪肠球菌；培养基优化；单因素优化；正交设计；肠球菌属（Enterococcus spp）是人和恒温脊椎动物肠道内的革兰氏阳性菌，有着非常重要的医学意义[1]
肠球菌广泛存在于各种乳制品和发酵食品中，不仅能够影响食品的风味和质地，还能产生乳酸、有机酸、乙醇、过氧化氢、双乙酰和细菌素等许多抑菌物质[2]
例如，一些肠球菌素具有广谱抗菌作用
粪肠球菌作为肠球菌属最常见的一种，现已作为益生菌和发酵剂广泛用于微生态制剂、保健食品以及发酵食品的工业生产中[3]
本文通过单因素优化及正交设计对一株猪源粪肠球菌进行了培养基优化，为该菌应用于微生态制剂提供理论基础
1.材料与方法1.1菌种粪肠球菌HEW-A317，由本试验室保藏的一株筛选自仔猪肠道的粪肠球菌，在常规MRS培养基上培养
1.2培养基种子培养基：牛肉膏10 g/L，酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，葡萄糖5 g/L，吐温80 1 ml/L，柠檬酸氢二铵 2 g/L，无水乙酸钠 5 g/L，K2HPO42 g/L，MnSO4·H2O 0.05 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，pH 6.8
MRS固体培养基：牛肉膏 10 g/L，酵母膏 5 g/L，葡萄糖 20 g/L，无水乙酸钠 5 g/L，柠檬酸氢二铵 2 g/L，吐温80 1 ml/L，MnSO4·H2O 0.05 g/L，K2HPO42 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，琼脂粉 18 g/L，pH 6.8
MRS液体培养基：牛肉膏 10 g/L，酵母粉 5 g/L，葡萄糖 20 g/L，无水乙酸钠 5 g/L，柠檬酸氢二铵 2 g/L，吐温80 1 ml/L，K2HPO42 g/L，MnSO4·H2O 0.05 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，pH 6.8
1.3生长曲线的绘制取粪肠球菌HEW-A317于MRS平板上活化两代，活化完成后于MRS斜面划线，37 ℃培养24 h
取2管斜面，分别用2 mL 0.9 %生理盐水将菌苔洗脱[4]
取1 mL菌液接种于液体MRS培养基，摇匀，取0 h的样品后于37℃，180 rpm条件下恒温摇瓶培养16 h
每1 h取一次样并立即进行活菌计数，计数方法采用固体MRS倾注法
1.4培养基优化1.4.1碳源及其添加量的选择选取葡萄糖、蔗糖、乳糖、糖蜜、可溶性淀粉作为碳源，以2 %的添加量取代MRS培养基中的碳源
37℃，180 rpm，培养16 h后进行活菌计数，计数方法采用固体MRS倾注法
最佳碳源选定后，按照1.0 %、2.0 %、3.0 %、4.0 %、5.0 %的添加量加入到MRS培养基中，培养16 h后进行活菌计数
1.4.2氮源及其添加量的筛选选择硝酸铵、硝酸钠、尿素、硫酸铵、硝酸钾、氯化铵、牛肉膏、蛋白胨、牛肉膏和蛋白胨组合(1:1)取代MRS中的氮源，添加量按照MRS培养基中氮含量及以上各种氮源含氮量来折算[5]
37℃，180 rpm条件下培养16 h后进行活菌计数
1.4.3无机盐和生长因子及其添加量的筛选确定最优碳源、氮源后，以最优碳源、氮源作为培养基的碳源、氮源，将MRS中的无水乙酸钠、柠檬酸氢二铵、磷酸氢二钾、一水合硫酸锰、七水合硫酸镁和吐温80分别单独加入培养基中，通过测定16 h活菌数得出各种无机盐及生长因子对粪肠球菌生长的相关性
根据各种无机盐、生长因子对粪肠球菌生长影响的大小，对其添加量进行筛选
1.4.4正交试验在单因素试验的基础上，确定了碳源、氮源，无机盐中MnSO4对HEW-A317生长影响较大，因此正交设计选取葡萄糖、蛋白胨和MnSO4三个因素，进行三因素三水平正交设计试验
1.4.5统计分析用Excel将不同培养基成分对HEW-A317的活菌数的影响进行整理，通过SPSS 16.0进行差异显著性分析
2.结果与分析2.1 粪肠球菌HEW-A317生长曲线的绘制​图1 粪肠球菌HEW-A317生长曲线和pH变化曲线Fig.1 Growth curve and pH curve ofEnterococcus faecalisHEW-A317如图1所示，粪肠球菌的生物量在1～2 h内没有明显的变化，pH保持在6.8左右，此时粪肠球菌处在迟缓期
2 h～7 h内，菌体呈对数增长趋势，8 h以后生长缓慢，10 h后进入稳定期，活菌数基本稳定
17 h后活菌数略有下降，可能是由于一部分菌体开始自溶
pH的变化曲线与粪肠球菌的生长曲线基本吻合，是由于粪肠球菌在生长过程中不断产生乳酸所致，所以对数期内pH急剧下降[6]
随着培养时间的延长，pH下降幅度逐渐减小，10 h后pH值基本保持不变
粪肠球菌在培养过程中不断受到自身发酵产物——乳酸的抑制，因此pH值的下降幅度会逐渐减小[7]
2.2 不同碳源对粪肠球菌活菌数的影响​图2 不同碳源对粪肠球菌HEW-A317活菌数的影响Fig.2 Effect of different carbon sources on the viable bacterial number ofEnterococcus faecalisHEW-A317从图2中可以看出，粪肠球菌的最佳碳源为葡萄糖，其次为乳糖和蔗糖，再次为糖蜜
淀粉不能被粪肠球菌很好的利用，淀粉是多糖，可能是因为乳酸菌在生长过程中缺少淀粉酶，不能把淀粉水解为单糖，因此对淀粉的利用效率极低[8]
而葡萄糖作为碳源对粪肠球菌的生长促进效果最为明显，因为葡萄糖是单糖，属于速效利用碳源，能够被粪肠球菌直接利用，迅速提高其生物量
2.3 葡萄糖的最佳添加量筛选​图3葡萄糖添加量对粪肠球菌HEW-A317活菌数的影响Fig.3 Effect of glucose addition on viable bacterial number ofEnterococcus faecalisHEW-A317随着葡萄糖添加量的加大，粪肠球菌的生物量在一定范围内也逐渐增大，当添加量达到3.0 %时，活菌数最高；超过3.0 %再增加葡萄糖的量，活菌数不但不增加，反而呈下降趋势，可能是因为糖浓度过高导致渗透压较高，菌体生长受到抑制
因此，葡萄糖的添加量在3.0 %处出现拐点，是最佳的添加量
2.4 不同氮源对粪肠球菌活菌数的影响​图4 不同氮源对粪肠球菌HEW-A317活菌数的影响Fig.4 Effect of different nitrogen sources on viable bacterial number ofEnterococcus faecalisHEW-A317从图4中可以看出，粪肠球菌对无机氮源的利用率较低，能够有效促进其生长的是牛肉膏和蛋白胨，属于有机氮源
这是因为粪肠球菌合成蛋白的能力较差，不易利用无机氮源，而有机氮源中含有丰富的氨基酸，较容易被吸收利用[8]
单独使用蛋白胨和混合牛肉膏使用效果相近，且牛肉膏的成本较高，因此为降低生产成本，选用蛋白胨作为粪肠球菌的氮源
2.5 蛋白胨的最佳添加量筛选​图5蛋白胨添加量对粪肠球菌HEW-A317活菌数的影响Fig.5 Effect of peptone addition on viable bacterial number ofEnterococcus faecalisHEW-A317确定最佳氮源后，选取蛋白胨的添加量分别为1.0 %、2.0 %、3.0 %、4.0 %、5.0 %，培养14 h后，进行活菌计数
从图5中可以看出，粪肠球菌的生物量随着蛋白胨的添加量的增加而上升，到3.0 %处出现拐点，因此蛋白胨的最佳添加量为3 %
2.6 不同无机盐、生长因子对粪肠球菌活菌数的影响​图6 不同无机盐对粪肠球菌HEW-A317活菌数的影响Fig.6 Effects of different inorganic salt on viable bacterial number ofEnterococcus faecalisHEW-A317以葡萄糖、蛋白胨作为基础培养基，分别向其中单独加入无水乙酸钠、柠檬酸二铵、磷酸氢二钾、吐温80、一水合硫酸锰、七水合硫酸镁进行试验，以不加无机盐和生长因子的基础培养基作为对照组
结果如图6所示，添加无水乙酸钠、柠檬酸二铵、吐温80、一水合硫酸锰对粪肠球菌的生长有促进作用
其中，一水合硫酸锰的促进作用最明显，其次为无水乙酸钠
而磷酸氢二钾和七水合硫酸镁对粪肠球菌生长的促进作用不明显
2.6.1 硫酸锰添加量的筛选​图7硫酸锰添加量对粪肠球菌HEW-A317活菌数的影响Fig.7 Effect of MnSO4addition on viable bacterial number ofEnterococcus faecalisHEW-A317以葡萄糖、蛋白胨为基础培养基，向其中分别加入0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 g/L的一水合硫酸锰，以不加一水合硫酸锰的基础培养基作对照
结果如图7所示，基础培养基中加入0.05 %的一水合硫酸锰能够明显提高粪肠球菌的生物量，超过1.0 %后促进用略有降低
因此，一水合硫酸锰的最佳添加量为0.05 %
2.6.2 无水乙酸钠添加量的筛选​图8无水乙酸钠添加量对粪肠球菌HEW-A317活菌数的影响Fig.8 Effect of sodium acetate anhydrous addition on viable bacterial number ofEnterococcus faecalisHEW-A317以葡萄糖、蛋白胨、硫酸锰(0.05 g/L)作为基础培养基，分别加入0.2 %、0.4 %、0.8%、1.0 %、1.2 %、1.4 %、1.6 %的无水乙酸钠，以不添加无水乙酸钠的基础培养基作对照
结果如图8所示，培养基中加入少量无水乙酸钠可以提高粪肠球菌的生物量，随着无水乙酸钠的添加量的增加，粪肠球菌的生物量逐渐增高，在1.4 %处出现拐点，因此无水乙酸钠的最佳添加量为1.4 %
2.6.3 柠檬酸氢二铵添加量的筛选​图9柠檬酸氢二铵添加量对粪肠球菌HEW-A317活菌数的影响Fig.9 Effect of diammonium hydrogen citrateaddition on viable bacterial number ofEnterococcus faecalisHEW-A317以葡萄糖、蛋白胨、硫酸锰(0.05 g/L)、无水乙酸钠(1.4 %)为基础培养基，分别向其中加入0.1 %、0.2 %、0.3 %、0.4 %、0.5 %、0.6 %、0.7 %的柠檬酸氢二铵
结果如图9所示，柠檬酸氢二铵的浓度在0.5 %以下时，粪肠球菌的生物量随柠檬酸二铵添加量的增加而增加，超过0.5 %时，粪肠球菌的生物量会逐渐下降
可能是因为柠檬酸氢二铵对粪肠球菌的糖代谢途径的关键酶——磷酸果糖激酶有调节作用，柠檬酸对磷酸果糖激酶有抑制作用，而适当浓度的NH4+可以解除这种抑制作用
因此，柠檬酸二铵的最佳添加量为0.5 %
2.6.4 吐温80添加量的筛选​图10吐温80添加量对粪肠球菌HEW-A317活菌数的影响Fig.10 Effect of Twin-80 on viable bacterial number ofEnterococcus faecalisHEW-A317吐温80是聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯，简称聚山梨酯-80，通常作为乳化剂和分散剂，一方面能够使培养基中的营养成分更加均匀，另一方面它是一种刺激因子，能够在一定程度上促进乳酸菌的生长[9]
从图10中可以看出，吐温80的最佳添加量是0.40 %
2.7 酵母粉最佳添加量的筛选​图11酵母浸粉添加量对粪肠球菌HEW-A317活菌数的影响Fig.9 Effect of yeast extract powder on viable bacterial number ofEnterococcus faecalisHEW-A317酵母浸粉即酵母浸出物(YEF——Yeast extract fermentation)，富含蛋白质、氨基酸、肽、多肽、维生素及微量元素等营养成分，在培养基中添加少量的酵母浸粉能够对乳酸菌的繁殖起到一定的促进作用[9]
从图11中可以看出，添加1.0 %的酵母浸粉对粪肠球菌生长的促进作用最明显
2.8 正交试验正交设计表见表1，试验结果见表2
表1正交设计表Tab.1 Orthogonal design table表2正交设计试验结果Tab.2 Results of orthogonal design experiment如表2所示，通过三种因素的R值来看，三种影响因素对粪肠球菌活菌数的影响大小排序为：A>B>C
根据k值可以确定，最佳组合为A2B2C3，即葡萄糖、蛋白胨、硫酸锰的添加量分别为3.0 %、3.0 %、0.07 g/L
因此最终培养基组合为：葡萄糖3.0 %、蛋白胨3.0 %、MnSO4·H2O 0.07 g/L、酵母粉1 %、无水乙酸钠1.4 %、柠檬酸氢二铵0.5 %、MgSO4·7H2O 0.2 %、K2HPO40.2 %、吐温80 0.4 %
​图12两种不同培养基中粪肠球菌HEW-A317的生长曲线Fig.12 The growth curves of two kinds of different culture medium ofEnterococcus faecalisHEW-A317使用优化后的培养基再次进行粪肠球菌HEW-A317的生长曲线测定，结果如图12所示
在优化后的培养基中，菌体在对数期繁殖更迅速，16 h的活菌数为16.99 CFU/ml，与初始的MRS培养基相比提高了58.79 %
3 结果与讨论3.1 结果粪肠球菌HEW-A317的最优培养基为：葡萄糖3.0 %、蛋白胨3.0 %、MnSO4·H2O 0.07 g/L、酵母粉1 %、无水乙酸钠1.4 %、柠檬酸氢二铵0.5 %、MgSO4·7H2O 0.2 %、K2HPO40.2 %、吐温80 0.4 %
3.2 讨论粪肠球菌是链球菌科、肠球菌属中的一员，是人类和动物肠道中正常菌群的一部分，广泛分布于自然界中[10]
利用无毒害、兼性厌氧菌的粪肠球菌配合枯草芽孢杆菌、酵母菌等益生菌制成微生态制剂(Animal Miroecological Agent, AMEA)，可调节动物肠道平衡，减少多种消化道疾病的发病率，有望代替抗生素的使用
本研究对一株猪源粪肠球菌HEW-A317进行了培养基优化，提高了摇瓶发酵活菌数，为提高发酵生产效率，降低生产成本提供了一些理论基础
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