5'/3' GSP(基因特异性引物)设计原则 ：引物长度：23 - 28个核苷酸，建议不超过30个核苷酸；GC含量：50% - 70%；Tm值：Tm≥65°C，Tm>70°C使用Touch Down PCR有助于提高产物特异性；对于较长片段(>10 kb)或丰度较低的待测转录本，GSP引物设计尽量靠近cDNA的末端(≤3 kb)；针对同一待测转录本可设计多条GSP，进行RACE扩增以提高成功率NGSP(巢式基因特异性引物)设计原则（可选）：1.引物长度、GC含量、Tm值：同GSP设计原则；位置：NGSP须设计在GSP的3'端，建议NGSP的5'末端与GSP的3'末端有5 - 15 nt的重叠，有助于提高二轮巢式扩增时的特异性2.如果上一轮 PCR 没有理想的特异产物（如无扩增产物、产物较弱、产物弥散），或者产物非特异条带过多、基因表达丰度低，巢氏PCR与RACE结合可以提高克隆的准确度，巢式引物结合在上一轮PCR产物的内部，进行PCR扩增可设计多轮巢式引物进行巢式PCR扩增友情提醒：巢式PCR可以提高扩增倍数，降低了非特异性反应连续放大进行的可能性，提高了实验的成功率常见问题解答1) 扩增较长片段有什么建议？➣ 建议扩增片段尽量不超过3 kb，靠近已知序列末端；➣ 设置温度梯度摸索最佳退火温度；➣ 检测样本RNA是否降解；➣ 扩增较长片段时应该适当延长变性时间；➣ GSP引物设计需要保证较好的特异性；2) 进行cDNA末端快速扩增时没有明显产物条带？➣ RNA提取物中无目的转录本或者目的转录本表达丰度低，可以设计已知转录本区域的qPCR或PCR引物进行目的产物检测；检测后发现表达丰度低，可以增加RNA模板投入量；➣ RNA降解：进行试验前检测RNA的完整度，可以通过RNA琼脂糖凝胶电泳观察RNA的完整度；➣ 设计Nested GSP，进行多轮巢式PCR（一般不超过3轮），富集产物片段同时保证了扩增产物特异性；➣ 待扩增目的片段过长：提高PCR延伸时间，GSP设计时尽可能放在序列末端；3) PCR出现明显杂带?➣ 目的基因属于多基因家族，可以进行数据库对比，针对特异性区段序列设计GSP；➣ 可能是RNA前体具有可变剪接形式，可以进行数据库对比，针对特异性区段序列设计GSP;➣ 扩增非特异性：设计额外的NGSP，进行多轮巢式PCR，将目的产物进行胶回收，再次进行RCP扩增4) 5' RACE成功，3' RACE失败是什么原因？3' RACE成功，5' RACE失败是什么原因？➣ 如果5'RACE能做出来，3' RACE做不出来，大概率是GSP引物的问题；如果3'RACE成功，5' RACE失败，可能与RNA完整度有关5) RNA不含poly A尾，加A处理后做了5' RACE 没有出现目的条带？➣ 逆转录后设计已知序列的qPCR引物或PCR引物，扩增逆转后的cDNA，如果没有扩增说明没有cDNA或含量较低，建议使用随机引物进行逆转，同时选择多条GSP进行PCR；如果有扩增产物，说明逆转录没有问题，可以进行巢式PCR富集特异产物6) 引物设计结果为空白是什么原因？➣ 引物设计结果为空白，可能是没有符合要求的引物序列，可以排查一下引物GC含量，GC含量太低或太高都会产生影响7) 5' RACE测序结果与软件比对结果相比多出3个G碱基？➣ 测序结果多出3个G碱基是RACE过程中加上去的，对实验结果不会产生影响，软件比对时把多出的碱基删除为真正的5'端序列8) 克隆产物测序结果不同，如何判断哪个是全长序列？➣ 转录本本身可能存在多种可变剪接形式，表明两个序列都是正确的尽量在实验中尽可能地增加克隆数测序，减少实验中的误差好啦～，今天的知识点小v就介绍到这里，如果在实验过程中有什么不懂的，可以随时来询问小v，或者直接联系身边的诺唯赞人，我们将竭尽全力为大家提供优质的服务和可靠的产品最后，希望大家做实验都能做出完美的结果
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