梵英超声(fanyingsonic)实验室超声仪器1.提取顺序1.1红枣去核切片→干燥粉碎、过 40 目筛→超声提取红枣多糖→离心取上清液→加入 4 倍体积无水乙醇醇沉过夜→离心取沉淀定容→苯酚硫酸法测多糖含量 以1.0g枣粉为基准,固定提取温度 60 ℃ ,超声时间30min,超声功率 300 W,研究不同液料比10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1 (mL∶ g)对红枣多糖提取率的 影响;固定液料比20∶ 1(mL∶g),超声时间 30 min,超声功率 300 W,研究不同提取温度40、50、60、70、80 ℃对红枣多糖提取率的影响; 固定液料比20∶1 (mL∶ g),提取温度 60 ℃ ,超声功率300 W,研究不同超声时间10、20、30、40、50 min 对红枣多糖提取率的影响;固定液料比 20∶ 1 (mL∶ g)、提取温度 60 ℃ 、超声时间30 min,研究不同超声功率100、200、300、 400、500 W对红枣多糖提取率的影响
1. 3.1.2响应面优化设计在单因素试验的基础上,固定超声功率 200 W, 确定超声温度、液料比以及超声时间的3因素3水平
利用 Design-Expert 8.0.6软Box-Behnken 法设计优化试验,以多糖提取率为响应值,研究提取红枣多糖的最优工艺参数
响应面水平如表1所示
表 1 响应面试验因素水平表表1反应面实验的影响因素及水平1.2红枣多糖分离纯化将最优条件得到的多糖样品进行石油醚脱脂,用石油醚和粗多糖溶液按1:1体积比充分混匀,用分液 漏斗分离,重复3次脱脂;Sevage法脱蛋白 ;通过透析去除小分子杂质,浓缩后冷冻干燥多糖组分,用于后续实验
1.3.指标测定采用苯酚硫酸法测定红枣多糖含量,回归方程为:y = 0.011x + 0.0064,R2 = 0. 9997
采用考马斯亮蓝法对红枣多糖蛋白质含量进行测定 ,回归方程为:y = 8. 1243x + 0. 0423,R 2 = 0. 9911
1.4.单糖组成在 80 ℃下,10 mg多糖用4 mL 2. 0 mol / L的三氟乙酸( trifluoroacetic acid,TFA) 水解 6 h,通过 N2 冲洗除去溶液中残留的TFA,然后溶于10 mL 超纯水中并通过SPE管和0. 22 μm超滤管进行澄清
2.光谱分析2.1紫外光谱分析将多糖溶液在 190 ~ 400 nm 波段下进行扫描,分 析扫描图谱,观察有无核酸吸收峰(260 nm) 和蛋白质吸收峰(280 nm),检测杂质是否去除干净
2.2红外光谱分析取适量干燥的多糖样品使用傅立叶红外光谱分析( Fourier transform infrared spectroscopy, FT-IR)在4000 ~ 400 cm - 1范围内扫描,使用 OMNIC软件分析结果
2.3.刚果红染色取1 mL 1 mg / mL 红枣多糖溶液、2 mL 60 μmol / L刚果红溶液及1 mL不同浓度的NaOH溶液,静置15 min后观察不同浓度的NaOH溶液中多糖最大吸收波长的迁移情况
3.抗氧化3.1.体外抗氧化总还原力的测定,参照 LIN等的方法;DPPH自由基清除能力测定, 参照许海顺等的方法; ABTS阳离子自由基清除能力的测定,参照胡治远等的方法
3.2斑马鱼模型的抗氧化作用发育 24h的皮肤荧光斑马鱼,使用链霉蛋白酶脱去其胚胎外层的卵膜后随机分成空白对照组(NC) 、5 mmol / L 甲硝唑造模组(MC) 、阳性对照组 (5 mmol / L 甲 硝 唑 + 100 μg / mL Vc ) ( PC ) 、 1 μg / mL红枣 多 糖 组 ( I) 和 25 μg / mL红 枣多糖组( II) ,在荧光显微镜下观察拍照
使用 Imageproplus 软件统计斑马鱼的皮肤荧光点数量,并利用 GraphPad 软件对数据进行统计分析,评估样品的抗氧化活性
3.3统计学分析试验平均操作3次,数据以x���±s表示,使用 SPSS软件进行单因素方差分析,P < 0.05表示差异有统计学意义
4.结果与分析功率100 ~ 200 W 时,多糖提取率升高,当超声功率继续加大时,多糖提取率反而下降,由于超声功率增大有助于细胞壁的破碎和液固两相的相互混合,多糖提取率增大,功率过强时,超声波空化作用加大,多糖糖苷键可能遭到破坏,影响多糖提取率
因此超声功率以200 W为宜
温度低时,分子运动慢使得多糖无法充分溶出,随温度升高,分子运动加快,多糖提取率升高
但是温度升高到50 ℃以上时,随温度升高多糖提取率反而降低,这可能因为温度升高影响多糖稳定性,多糖糖链降解,多糖提取率降低
因此,适宜红枣多糖提取的温度为 50 ℃
溶剂较少时不利于多糖扩散
随液料比增大,多糖提取率升高,在液料比 15∶ 1时达到最大值
随后提取率降低,随着溶剂增加,多糖尽可能游离到溶液中,但溶剂量过大,大量杂质也会溶出,挤占多糖空间,导致提取率不升反降
因此,最适宜的液料比为15：1