然后小编觉得很有道理，于是就在第四期内容，给同学们，整理出这篇1.2 w字的详细保姆级SnapGene教程
如果没有学会的或还是欠点意思的建议收藏保存往复多看几遍多操作几遍，我觉得SnapGene软件应该对同学们来说是没有问题了同时小编在这里说明，支持正版SnapGene软件（懂的都懂）
这期内容讲解主要应用SnapGene6.0.2版本进行实战讲解下面是本期课程的内容框架，基本大致围绕框架进行讲解，但会着重介绍SnapGene6.0.2软件功能应用
注：要想学习好SnapGene软件，第4部分的内容很重要
后面有小编觉得讲解SnapGene软件比较好的视频教程链接本期内容框架1SnapGene软件概览1.1 SnapGene软件简介SnapGene软件是一款强大的基因编辑软件，它可以帮助科研小伙伴们更轻松地进行基因组编辑和研究同时，SnapGene软件支持多种基因编辑工具，包括CRISPR/Cas9、TALEN、ZFN等，还包含了序列编辑和标记、质粒图谱构建、酶切位点分析、序列比对等多种功能，可以满足不同生物学研究人员对相应序列进行分析的操作不仅如此，还是一款强大而易于使用的分子生物学实验设计和分析工具，帮助科学家和研究人员更高效地进行基因工程和分子生物学研究它提供了直观的界面、丰富的功能和可视化工具，简化了实验设计、数据分析和结果展示的过程1.2 SnapGene软件用途1.2.1 DNA序列编辑和设计SnapGene提供了直观的界面，可用于编辑、设计和构建DNA序列用户可以进行序列插入、删除、复制和反转等操作，以及添加或修改限制性内切酶位点此外，SnapGene还支持PCR引物设计、引物扩增和序列组装等功能1.2.2 限制酶酶切图谱分析SnapGene可以自动分析DNA序列中的限制酶切位点，并生成直观的酶切图谱用户可以查看DNA片段的预测酶切模式，快速评估酶切方案的可行性，并选择合适的酶切酶进行实验1.2.3 转录和翻译分析SnapGene可以帮助用户分析DNA序列的转录和翻译过程它提供了转录起始位点和终止位点的预测，并可显示编码蛋白质的氨基酸序列用户可以直观地查看ORF（开放阅读框）和编码蛋白质的特性，以及序列中可能存在的转录调控元件1.2.4 Plasmid图设计和构建SnapGene支持Plasmid（质粒）图的设计、编辑和可视化用户可以快速构建质粒图，添加、删除或修改基因、启动子、标签和其他功能元件它还提供了可定制的注释和图形标记，使得质粒图更加清晰和易于理解1.2.5 DNA文档和分享SnapGene允许用户创建详细的DNA文档，包括序列信息、注释、图形标记和参考文献等这些文档可以方便地保存、共享和印刷，以支持实验设计、报告撰写和实验室交流1.3 SnapGene 6.0.2版本安装1.3.1 打开安装包，点击安装（注：该6.0.2版本来源于正版购买）图片来源：截图1.3.2 默认路径，然后按顺序安装，直到安装完成即可图片来源：截图图片来源：截图2怎么白嫖最新版SnapGene软件？SnapGene软件几乎每年都会更新版本更新版本后，有些新功能是旧版不能用的，例如6.0.2版本就是不能使用“golden gate”这一功能
那么问题来了，我们想使用一下“golden gate”这个功能，但是又不经常用，这时候我们该怎么办呢？每当这时候小编都会说一句“只要思想不滑坡，办法总比困难多”小编在这里给大家介绍这么一个办法
首先去SnapGene官网申请最新版本免费试用版
就可以免费白嫖1个月啦
只要不花钱，小编就觉得“香”
既省时又省力，那可真是太棒了
同学们，给我“香”起来，哈哈哈哈
开玩笑
说说它们的优缺点吧
优点毋庸置疑的就是我们可以使用到最新版本的功能，同时还可以白嫖最新版本使用1个月
不仅可以解决了眼前难题，又可以白嫖我们不常用的功能，真是省钱又省力的好软件啊
这也太香了吧
缺点就是要先把我们现有的SnapGene软件卸载，重装最新版本SnapGene软件，为什么呢？首先是避免新旧软件覆盖的问题，出现路径不同，而导致报错；其次就是避免旧版本出现升级，然后不能使用旧版本，而要重新购买等问题下面小编为大家介绍一下怎么申请SnapGene软件免费试用版吧
首先，进入SnapGene官网（www.snapgene.com）图片来源：截图其次，输入邮箱，提交申请图片来源：截图然后，按照下面的选择“Yes”和“Student”，提交图片来源：截图再然后，获取登录安装信息：组名、登记密码（激活软件）、试用截止日期图片来源：截图最后，根据电脑系统，选择下载安装包，按顺序安装，输入组名、登录密码即可使用图片来源：截图小编觉得SnapGene 7.0.2版本和旧版本区别挺大的
首先是全新的欢迎界面，很大程度上提高了用户的体验感；其次是选项卡式界面、文件和文件夹管理文件及文件搜索，一定程度上提高我们的工作效率；最后是引物注释和新序列的预览检测功能，不仅添加/编辑引物注释，还增加新序列预览窗口3SnapGene基本功能3.1 SnapGene软件基本界面（下面以6.0.2版本为例）3.1.1 SnapGene 6.0.2版本的欢迎界面图片来源：截图3.1.2 SnapGene 6.0.2版本左下角是可以转换语言的，有“中文”、“英语”、“日语”三种语言，小编在这里为了让大家更好更快熟悉界面，选择了中文语言图片来源：截图3.1.3 SnapGene 6.0.2版本新建DNA/RNA文件图片来源：截图图片来源：截图图片来源：截图3.1.4 打开文件图片来源：截图图片来源：截图图片来源：截图SnapGene官网（www.snapgene.com）中有很多常见的质粒文件，如果找不到合适的可以到SnapGene官网中查询
图片来源：截图3.1.5 导入文件3.1.5.1 方法一：点击进入找到SnapGene在线序列，搜索自己需要的序列图片来源：截图图片来源：截图3.1.5.2 方法二：点击文件，找到输入，再选择和导入Addgene质粒文件或者通过输入序列号导入NCBI、UniProt、Ensembl等机构发布的序列图片来源：截图图片来源：截图图片来源：截图图片来源：截图3.2 工具栏介绍SnapGene软件工具栏分三部分：顶部工具栏、左侧工具栏和底部工具栏那么，我们来聊一聊这三部分工具栏分别代表什么吧？图片来源：截图3.2.1 顶部工具栏（编辑操作）3.2.1.1 文件在文件中，标红框是经常使用的功能操作键图片来源：截图3.2.1.2 编辑图片来源：截图3.2.1.3 查看图片来源：截图3.2.1.4 查看图片来源：截图3.2.1.5 特征图片来源：截图3.2.1.6 引物图片来源：截图3.2.1.7 行动图片来源：截图3.2.1.8 工具图片来源：截图3.2.1.9 窗口图片来源：截图3.2.1.10 帮助图片来源：截图3.2.2 左侧工具栏（编辑操作）图片来源：截图3.2.3 底部工具栏（编辑操作）3.3.2.1 图谱图片来源：截图3.2.2.2 序列图片来源：截图3.2.2.3 酶图片来源：截图3.2.2.4 特征图片来源：截图3.2.2.5 引物图片来源：截图4SnapGene软件应用4.1 自定义DNA序列配色4.1.1 选择一段序列区域图片来源：截图4.1.2 自定义颜色序列点击【Edit】编辑→【Set DNA Color...】设置DNA颜色...图片来源：截图或者点击侧栏中的“显示颜色”菜单按钮，然后点击设置DNA颜色…图片来源：截图4.1.3 选择配色图片来源：截图4.1.4 预览自定义配色图片来源：截图4.2 修改字体大小图片来源：截图注：字号大小的修改会应用到SnapGene所有的文件，比如Map、序列、酶、引物、以及历史记录；字号大小会影响一些展示的宽度；如果SnapGene里的字号修改依然无法适配您的要求，请检查您电脑显示器分辨率的设置4.3 导出为矢量图片图片来源：截图4.4 获取载体序列很多实验室同学，会经常遇到这样的情况，不知道从哪里获取载体序列，其实这也是很正常的，毕竟刚刚步入研究生科研生活所以不要担心，这都是正常情况下面让小编来带你来学习一下怎么获取载体序列吧
获取载体序列主要介绍NCBI / addgene / SnapGene三种序列信息检索网站现在互联网查找基因信息是很方便的，在很多网站都可以查找到基因信息序列而比较常用的经典基因数据库有NCBI、UCSC下面我们就以pEGFP-C1构建human p53 CDS过表达载体为例，分享一下如何快速获取需要的序列信息我们需要获取的序列信息有两类，一类是p53 CDS也就是插入片段的序列，另一部分是载体的序列4.4.1 从NCBI获取P53的CDS序列NCBI官网 / nuccore / 核酸数据库，输入基因名点击搜索在弹出的页面中，选择物种类别，以及核酸类别然后对弹出的页面信息进行初步筛选甄别，看是否是我们需要检索的内容，最后在右侧菜单中筛选人类，以此来缩小检索范围图片来源：截图经过human的物种筛选后，弹出的页面中置顶的这一条，就是人类的p53 RNA，点击进入详细页面，我们可以看到在详细页面中默认显示的是GenBank格式，我们可以调整为FASTA格式GenBank格式有序列的详细信息，FASTA格式序列方便我们拷贝、编辑图片来源：截图打开GenBank格式的p53序列，我们可以看到p53 mRNA长度是从1bp-2451bp，其中CDS是64bp-1245bp，同样我们可以看到CDS翻译的蛋白质序列以及对应蛋白质序列的ID，方便我们进行检索，检索完成后，通过右侧“send to”进行下载图片来源：截图打开NCBI官网，进入GENE数据库，检索p53基因，确定物种为人类，就可以定位到TP53，点击进入详细页面，根据简介来判断是否为正确的检索，正确后向下拉，在页面中部可以看到p53的基因结构点击“GenBank”进入详细页面，我们可以看到p53的mRNA，通过“NM0011..”可以跳转到mRNA页面图片来源：截图图片来源：截图图片来源：截图图片来源：截图4.4.2 从Addgene获取载体pEGFP-C1如何检索载体pEGFP-C1? 通常有两种方式：第一，通过百度搜索名称进行检索，得到的结果大概率会导向Addgene我们以Addgene直接检索，更快捷的得到pEGFP-C1的准确信息打开官网，在右侧搜索栏按载体名称进行检索为了缩小范围，我们可以在检索中进行设置，在右侧可以看到检索结果的简介图片来源：截图图片来源：截图点击进入详细页面后，从左到右，依次为载体线性图谱，序列等信息，可在线blast，比对，查找限制性内切酶位点、ORF翻译产物等图片来源：截图第二，通过SnapGene来对pEGFP-C1进行检索进入SnapGene官网，在主菜单栏第五个，选择质粒文件数据库，然后按照质粒的名称进行筛选，或者按照载体用途、性质来进行检索右侧方框展示的为载体序列，查看等功能，左侧方框为pEGFP-C1载体分类图片来源：截图图片来源：截图4.4.3 其他1. Google 及 Google 学术检索式: 质粒名 + map；质粒名+sequence+filetype:txt or filetype:pdf或者: 进入google，点击[图片搜索] ，直接查找图谱2. 欧洲分子生物实验室MBL：http://www.ebi.ac.uk/3. 如何查找经过改造过的质粒的质粒图有些质粒是经过改造的，所以通过上述方法不能查询到相应信息这时，可以在google scholar中输入质粒名称，可以直观地看哪些学者在何文竟中使用了该质粒，从而可了解到质粒的来源或者籍此向作者咨询或索取4.5 质粒图谱以pUC57质粒为例，怎样画出其质粒图谱呢?首先我们在NCBI上下载pUC57的FASTA序列打开SnapGene，选择第一个功能New DNA File将序列粘贴进去后，点击ok(这里由于是环状质粒，所以选择了默认的Circular) 软件自动识别除了9个通用的元件，包括氨抗性基因 (AmpR) 、lac操纵子、复制起点 (ori) 等，点击【Add 9 features】，进入SnapGene的主界面图片来源：截图图片来源：截图4.5 质粒图谱的具体编辑方法4.5.1 序列标注由于之前打开序列文件的时候，软件自动识别出了9个常见的元件，所以也同时自动生成了载体图谱而当我们点击Sequece界面时，也可以看到相应的元件已经标注在序列上了图片来源：截图当然我们也可以自己编辑，双击lacZa的文字即可进入feature编辑界面，可以编辑序列名称、方向、范围以及颜色等信息，编辑完成后点OK，Sequence界面就会出现相应的序列注释信息如果我们要新添加一段序列注释，则选择相应序列，点击工具栏【Features】-【Addfeature】 ，同样会进入Feature编辑界面图片来源：截图4.5.2 序列比对序列比对的软件有很多，SnapGene用于序列比对的优势在于其序列是双向的，比对时不用考虑序列方向问题操作也比较简单，左侧工具条最下方的按钮就是序列比对，点击后导入需要比对的序列即可比对结果中比对不上的地方用红色标注图片来源：截图另外SnapGene也支持测序文件导入 (.abi文件)，例如我们先打开一个参考序列，再通过序列比对按钮将需要比对的测序文件都打开，就能获得多序列比对的结果，!点击左侧序列则能直接查看峰图，非常方便图片来源：截图4.6 引物设计4.6.1 什么是引物？引物是一种特殊的核酸序列，用于在实验室中特异性地识别和扩增目标DNA或RNA序列图片来源：截图4.6.2 引物的特性它们必须与模板分子上的序列相对应（必须与模板链互补）（1）引物有长短之分短引物主要用于扩增小而简单的DNA片段，而长引物用于扩增真核基因组DNA样本引物不宜过长（> 30-mer primers）或过短过短的引物会产生不准确的非特异性DNA扩增产物，过长的引物会导致杂交速率降低平均而言，需要扩增的DNA片段大小应该在1-10 kB以内（2）引物结构要相对简单，不含内部二级结构，避免内部折叠同时，还需要避免“Primer-Primer”退火，这种退火会产生引物二聚体并破坏扩增过程设计时，如果不确定要在引物的某个位置放置什么核苷酸，可以在该位置包括多个核苷酸，称为混合位点也可以使用基于核苷酸的分子插入物（肌苷）来代替常规核苷酸，以实现更广泛的配对能力4.6.3 引物设计要求a. 18-24个碱基的长度；b. G / C含量在40-60％；c. 起止于1-2 G/C对；d. 熔化温度（Tm）为50-60°C；e. 引物对之间的Tm应在5°C之内；f. 引物对不应该有互补区域；4.6.4 SnapGene引物设计操作4.6.4.1 点击Peimer，选择Add Primer，粘贴引物序列图片来源：截图图片来源：截图4.6.4.2 选择绑定位点可以从在序列上选择所需的绑定站点开始点击鼠标并拖动以进行选择，相应引物的熔化温度就会显示出来在所选位置添加引物，Primers→Add Primer图片来源：截图4.6.4.3 引物命名图片来源：截图4.6.4.4 修改引物图片来源：截图4.6.4.5 查看结合部位和溶解温度图片来源：截图4.6.4.5 查看设计完的引物图片来源：截图4.6.4.6 查看引物的结合位点图片来源：截图4.6.4.7 调整杂交参数图片来源：截图图片来源：截图4.6.4.8 隐藏/显示引物图片来源：截图图片来源：截图4.6.4.9 导入引物，如何将引物从一个文件夹导入另一个文件夹1. 打开目标文件夹图片来源：截图打开将接收导入的引物的文件SnapGene将仅导入可与目标文件序列杂交的引物如果目标文件已包含引物，则SnapGene默认情况下不会复制现有的引物，但会提供导入重复的引物的选项可以从以下来源导入引物：一个 .dna 源文件一个.txt .csv，.tsv 或 .rtf 格式的列表一个 Vector NTI® 数据库或oligo文件一个 Clone Manager 引物文件下面分别讲解一下如何用SnapGene操作以上四种导入引物的步骤（1）导入一个 .dna 源文件图片来源：截图图片来源：截图（2）导入一个.txt .csv，.tsv 或 .rtf 格式的列表图片来源：截图图片来源：截图（3）导入一个 Vector NTI® 数据库或oligo文件图片来源：截图图片来源：截图（4）导入一个 Clone Manager 引物文件图片来源：截图图片来源：截图2. 查看Available Primers List图片来源：截图3. 指定添加哪些引物图片来源：截图4. 查看导入的引物图片来源：截图5. 导出引物序列图片来源：截图4.7 Actions里面常用的功能介绍图片来源：截图在介绍这里常用的功能，小编换SnapGene中文版进行讲解，为什么呢？主要考虑到很多小伙伴对这个软件还不熟悉，如果用SnapGene英文版本，会到增加一定的难度，因此小编在这里就选择SnapGene中文版进行讲解，确保大家可以一次性学会
下面先介绍“Actions”在SnapGene中文版对应的名称“行动”那么，在“行动”中有哪些功能呢？我们看下图即可图片来源：截图4.7.1 限制和插入片段克隆这个功能在SnapGene软件第三期内容已经介绍过了所以这期就不进行讲解了
有不知道的小伙伴，可以到SnapGene软件第三期去学习4.7.2 线性连接、环化、退火寡核苷酸以及氨基酸序列为了让小伙伴更加直观的学习SnapGene线性连接，小编在网上收集了一些相关视频，供大家直观的学习，提供学习效率，避免因图文讲解导致学习效率降低视频教程链接（四方居士）：https://www.bilibili.com/video/BV1PU4y1b77G?vd_source=547c29f700b989ec897052cb649c5a28图片来源：截图不过小编提示，该视频使用的是SnapGene 4.3.5版本，和目前的最新版本是有一些区别，但对于学习SnapGene软件基本功能影响是不大的4.7.3 聚合酶链反应（PCR）聚合酶链式反应(PCR)是一种用于放大扩增特定的DNA片段的 分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加视频教程链接（四方居士）：https://www.bilibili.com/video/BV1pt411C7gW?vd_source=547c29f700b989ec897052cb649c5a28图片来源：截图4.7.4 重叠延伸PCR重叠延伸PCR (Overlap Extension PCR)，又称为SOE-PCR(Splicing by Overlap Extension PCR)，是一种用于构建DNA重组或基因突变的分子生物学技术它通过两轮PCR反应，将两个或多个DNA片段的重叠部分连接起来视频教程链接（四方居士）：https://www.bilibili.com/video/BV1Bv4y1c7ya?vd_source=547c29f700b989ec897052cb649c5a28图片来源：截图4.7.5 Gateway 克隆Gateway克隆是一种高效的DNA重组技术，用于构建重组DNA它基于Gateway技术，利用特殊的重组酶将DNA片段插入到预先构建好的载体中图片来源：截图4.7.6 Gibson AssemblyGibson Assembly是一种高效的DNA片段连接方法，用于构建重组DNA它基于酶体外的DNA连接酶活性，不需要限制性内切酶和连接酶，因此避免了酶切和连接步骤中可能出现的限制性酶位点缺失和连接错误的问题图片来源：截图4.7.7 NEBuilder HiFi DNA组装NEBuilder HiFi DNA组装是一种高效的DNA片段连接方法，用于构建重组DNA它基于NEBuilder HiFi DNAAssembly Master Mix，该酶混合物包含了高效的DNA连接酶、高保真度的DNA聚合酶和缺失校正酶视频教程链接（四方居士）：https://www.bilibili.com/video/BV1E24y137iW?vd_source=547c29f700b989ec897052cb649c5a28图片来源：截图4.7.8 In-Fusion 克隆In-Fusion克隆是一种高效的DNA重组技术，用于构建重组DNA它基于酶体外的DNA连接酶活性，不需要限制性内切酶和连接酶，因此避免了酶切和连接步骤中可能出现的限制性酶位点缺失和连接错误的问题图片来源：截图4.7.9 TA或GC克隆TA克隆和GC克隆都是常见的DNA克隆技术TA克隆是一种利用特殊的TA酶切酶和TA克隆载体进行的克隆技术，它适用于克隆PCR产物或其他具有A尾的DNA片段GC克隆则是一种利用GC富集的克隆载体和GC富集的DNA片段进行的克隆技术，它适用于克隆GC含量高的DNA片段两种克隆技术各有优缺点，选择哪种克隆技术应根据具体的实验需求进行决定视频教程链接（四方居士）：https://www.bilibili.com/video/BV1nm4y1P7ee?vd_source=547c29f700b989ec897052cb649c5a28图片来源：截图4.7.10 TOPO克隆TOPO®克隆（基于拓扑异构酶的克隆技术）不需要限制性内切酶或外源连接酶，从而提供了将新的PCR产物克隆到质粒中的极其简便快捷的方法该技术依赖于互补的碱基对腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)的基本能力来杂交并形成氢键视频教程链接（四方居士）：https://www.bilibili.com/video/BV1X8411L742?vd_source=547c29f700b989ec897052cb649c5a284.8 模拟琼脂糖凝胶电泳图片来源：截图比如，这里我们对插入的目的基因进行电泳检测图片来源：截图图片来源：截图最后，保存质粒图片，或者保存为SnapGene文件，以便日后再编辑如果还有同学没有学会SnapGene软件，小编在这里推荐大家一个小编自认为很不错的博主视频教程：【四方居士】他的教程真得很全很详细，对于初学者真的很有帮助，下图是他的教程截图图片来源：截图5SnapGene常见问题5.1 质粒提取浓度高低不一的问题作为一个实验小白，在很多时候提取质粒所得造成的浓度差异是很大的，有的浓度高达500-600ng/μL，有的才只有几十小编也时常会遇到这种情况，为什么用的都是一样的东西（试剂盒和菌株），但质粒提取的浓度为什么会有这么大的差异呢？要解决这个问题，我们首先要了解质粒
1. 拷贝数对于质粒载体，拷贝数是我们最关心的特性之一实际上，每个细菌中的质粒的拷贝数主要决定于质粒本身的复制特性按照复制性质，可以把质粒分为两类:严紧型质粒：当细菌染色体复制一次时，质粒也复制一次，每个细菌内只含1~2个质粒松弛型质粒：当细菌染色体复制停止后仍然能继续复制，每一个细菌内一般含20个左右质粒拷贝这些质粒的复制是在寄主的松弛控制之下的，每个细菌中含有10-200份拷贝，如果用一定的药物处理抑制寄主蛋白质的合成还可使质粒拷贝数增至几千份当然，恒定的拷贝数与质粒复制控制系统、质粒的大小及培养条件有关
那么到这里你可能会问，高拷贝质粒我们可以多提一点质粒，低拷贝数的质粒有什么作用呢？确实，低拷贝数的质粒用途不是十分广阔，主要用于以下两点：（1）高拷贝数的质粒往往不稳定，进行大片段克隆或者带有毒性DNA克隆时会用低拷贝（2）质粒的扩增会占用大量资源，当载体用于表达或者其他用途时，也会使用上低拷贝质粒图片来源：123rf2. 质粒的接合转移与穿梭质粒质粒的接合转移：是细菌遗传物质转移的一个重要方式在质粒转移过程中，供体菌和受体菌通过结合作用紧密接触，质粒从供体细胞向受体转移，同时进行质粒复制按能否自主转移，可以将天然存在的质粒分为转移型质粒和非转移型质粒两大类这里要注意的是，获得质粒的细菌可随之而获得一些生物学特性，如耐药性或产生细菌素的能力等从环境友好出发，实验室里的废弃菌液，一定要灭过菌才能倒哦穿梭质粒：是指一类人工构建的具有两种不同复制起点和筛选，因而可以在两种不同类群宿主中存活和复制的质粒载体此概念不仅用于不同的微生物菌群之间，也可以推广到真核生物表达载体的构建，如用于枯草的pBE2、酵母的pPIC9K、哺乳动物表达载体pMT2 和用于植物细胞的Ti 质粒这些穿梭质粒不仅可以在大肠杆菌中复制扩增，也可以在相应的枯草、酵母、动物或植物细胞中扩增和表达这样利于对质粒的分子生物学操作和大量制备3. 质粒的不相容性通俗来说，就是一山不能容二虎但是作为科学来说，我们需要一个严谨的定义："利用同一复制系统的两个质粒会在复制和随后向自细胞的分配过程中彼此竞争，这样的质粒在细菌培养物中不能和平共处，这种现象称之为不相容性”图片来源：123rf5.2 怎么才能在一个菌里面使用两个质粒呢？简单的方法就是使用不同复制源的且带有不同抗性基因的两个质粒5.3 构建质粒PCR常见问题扩增基因的过程并不困难，但未必能保证百分之百的成功率，可能原因：1. 结果出现引物二聚体、非特异性条带(大小不对)的现象，可以通过降低模板和引物的浓度、降低镁离子浓度、适当减少酶量，提高退火温度，来提高扩增特异性2. 出现凝胶条带弥散状态，多为模板不纯、反应体系中各成分比例不合适、退火温度设置偏低、循环次数过多等原因3. 长片段基因的扩增容易增加点突变和错配率，选用高扩增能力、高保真、可靠性强的聚合酶也很关键图片来源：123rf5.4 无法成功克隆到基因原因：引物设计不合理，模板质量不高解决方法：多找几个模板同时进行克隆；重新评估引物的合理性和特异性，比如将引物长度增至40 bp左右5.5 酶切位点的选择这一点很重要通常很多同学在选择酶切位点时，会习惯性的选择师兄师姐们常用的酶切位点，比如BamHI等，但实际上这样是不行的此时需要注意: 目的基因中不能出现所选酶切位点，否则，在连接时，残留的酶会对目的基因进行切割，这将直接导致实验的失败解决办法：选择酶切位点前，需要检查所选酶切位点是否存在于目的基因中5.6 如果构建质粒载体失败了，怎么办？构建质粒载体不成功我们可以根据引物设计是否合理？酶切位点是否选择正确？模板质量是否较好？PCR程序是否设置正确？如果以上几点都没问题，那载体构建就不会出问题5.7 如何选择正确的菌体和载体图片来源：截图图片来源：截图图片来源：截图5.8 其他问题在操作酶切连接的步骤时也要定性定量，保证酶活性充足，例如：双酶切尽可能选择同种缓冲buffer，一般用量40U单位以上（用量不超过总体积1/10），保证酶切过程充分；可根据目标片段量（ng）=（载体量 (ng） x 目标片段长度（kb）/（载体DNA片段长度(kb)）x目片段和载体的摩尔比（1:3-1: 8）计算出目标片段和载体的加入量，提高连接效率构建好的载体放入感受态细胞中转化（TOP10、DH5a、BL21等，感受态细胞在使用时尽可能保证新鲜，避免反复冻融，冰上孵育和热激时间应严格控制），经抗性、菌落PCR、酶切、测序等多道程序验证，确定是否转化成功，最终获得正确的重组克隆基因片段说明：图片来源：123rf小编制作公众号是为了分享更多有趣的软件，帮助更多科研小伙伴，助力科研需要获取软件，请关注小编公众号，进入首页，点击“科研软件”，添加小编微信私聊，并备注“学校/单位-姓名”科研软件仅供学习交流分享使用，版权归原作者所有，文章只代表作者本人观点，不代表公众号立场如有侵权，请联系我们删除，感谢支持
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